酶传感器是以酶作为生物识别元件,在酶传感器的构建中,传感器的稳定性和长久使用性特别受到研究者的重视,这两个方面在一定程度上与酶的固定化方法有很大的关联,因此为了提高稳定性,并且延长传感器的寿命,选择合适的固定化方法至关重要。常用的酶固定化方法主要有吸附法、包埋法(也称网格法)、共价键合法、交联法以及微胶囊法,应用最多是前四种方法,如图5.3所示。
图5.3 酶的常用的四种固定化方法
(1)吸附法
吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法,是固定化方法中最简单的方法。酶与载体之间的亲和力是范德华力、疏水相互作用、离子键和氢键等。吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。物理吸附法是通过物理方法将酶直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定的方法,是制备固定化酶最早采用的方法。这种固定化方法的优点是操作简单、价廉、条件温和,载体可反复使用,酶与载体结合后,活性部位及空间构象变化不大,固定后的酶活力较高。但这种固定化方法的缺点也同样明显,酶和载体结合不牢固,在使用过程中容易脱落,容易受到其他外界因素的干扰,制备出来的传感器灵敏度下降明显,所以吸附法常与交联法结合使用。
(2)包埋法
包埋法是指酶被包埋在聚合物膜或者凝胶的格子形结构中的固定化方法。常用的包埋材料有光电聚合物、褐藻胶和乳胶、电化学合成聚合物等。包埋的过程中,通常是将酶与其他电子媒介一起包埋在聚合物中,其中使用最多的是电化学聚合法,通过电化学聚合方法将酶与单体一起聚合到载体上,并通过酶与单体的吸附和静电作用将酶嵌入聚合物中。该方法具有以下优点:单体的聚合和酶的固定可以一步完成,固定量容易控制,稳定性好。(www.xing528.com)
(3)共价键合法
共价键合法是将酶与聚合物载体以共价键结合的固定化方法。最普遍的共价键结合基团是氨基、羧基以及苯环。常用来和酶共价耦联的载体的功能基团有芳香氨基、羟基、羧基和羧甲基等。这种方法是固定化酶研究中最活跃的一大类方法,但必须注意,参加共价结合的氨基酸应当是酶催化活性非必需基团,如若共价结合包括了酶活性中心有关的基团,会导致酶的活力损失。用共价键合法制备的固定化酶,酶和载体之间都是通过化学反应以共价键耦联的。由于共价键的键能高,酶和载体之间的结合相当牢固,即使用高浓度底物溶液或盐溶液,也不会使酶分子从载体上脱落下来,所以该方法使得酶的稳定性好且可连续使用较长时间。但是采用该方法时,载体活化的难度较大,操作复杂,反应条件较严格。
(4)交联法
交联法是使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法。由于酶蛋白的功能团,如氨基、酚基等,参与反应,所以酶的活性中心构造可能受到影响,使酶明显失活。该方法中使用最广泛的是戊二醛,戊二醛和酶蛋白中的游离氨基发生反应,形成薛夫碱,从而使酶分子之间相互交联,形成固定化酶。
以上四种酶的固定化方法各有其优缺点。往往一种酶可以用不同方法固定化,但没有一种固定化方法可以普遍地适用于每一种酶。在实际应用时,常将两种或数种固定化方法并用,以取长补短。表5.3列举出了四种固定化方法的优缺点。
表5.3 四种酶固定化方法的比较
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