凝血因子病毒处理的方法和技术

（一）有机溶剂/去污剂法（S/D法）处理

凝血因子制品（凝血因子Ⅷ、PCC、凝血因子Ⅸ、凝血因子Ⅻ等）的核心病毒灭活，通常采用S/D法处理。由于去除S、D的需要，S/D法处理应该在生产过程中进行，而不是对最终产品进行的。

凝血因子Ⅷ的S/D法处理通常针对低纯组分（例如冷沉淀）。常见工艺如下：以3或4倍体积缓冲液（三异丙基乙磺胺或枸橼酸盐缓冲液）或注射用水溶解冷沉淀，再用氢氧化铝做预纯化处理以部分除去其他凝血因子，继而用离心法分离。上清液用1 μm或0.45μm过滤器进行过滤以除去粒子，再进行S/D法处理。S/D组合通常是0.3%TNBP与1%吐温80或1%Triton X-100。S/D法处理温度通常接近25℃，处理时间为1～6 h。一般经过几分钟处理就能灭活4个数量级以上的脂包膜病毒。在S/D法处理后，蛋白溶液可能会通过层析法（例如能吸附凝血因子Ⅷ的DEAE阴离子交换柱）纯化，S、D在流动相中分离出去。要有效除去S、D，对层析柱进行充分洗涤非常重要。通常用10倍柱体积以上的平衡液进行洗涤。对于凝血因子Ⅷ和假性血管性血友病因子（vWF）可通过增加缓冲液中的离子强度（氯化钠含量）进行洗脱。TNBP的残留量应低于10μg/g，吐温80的残留量应低于100μg/g。

应在特殊设计的容器里进行S/D法处理。它们通常用316 L不锈钢材质制成。容器应完全封闭，并配备适当的搅拌装置和控温装置。这类容器通常具有卫生光洁的内表面、冲洗装置阀门、用于添加S/D和取样（例如，用于控制pH的取样）的清洁入口、用于相关过程中监测（比如测量温度）的检测口。容器应该无“死点”，比如误差范围之外的温度区域，或不均匀混合的区域。温度监测设备应在处理全程提供连续、准确、永久的温度记录。

（二）巴氏消毒处理

凝血因子的核心病毒灭活处理也包括巴氏消毒处理。对凝血因子Ⅷ/vWF的巴氏消毒，需要加入高浓度的稳定剂，如糖类（如蔗糖）、多元醇类（如山梨醇或甘露醇）和（或）氨基酸类（如赖氨酸和精氨酸）。由于需要去除这些稳定剂，该处理是在生产过程中进行的，而不是对最终产品进行的。在60℃热处理10 h后，通常用超滤法除去这些稳定剂。已证明对含有凝血因子Ⅸ和凝血因子Ⅻ溶液进行巴氏消毒是较困难的，因为热处理可能造成活性的巨大损失，因此这些产品的病毒灭活首选S/D法处理。(www.xing528.com)

巴氏消毒处理也应在特殊设计的容器（巴氏消毒柜）里进行。

（三）纳米膜过滤或干热处理

经过核心病毒灭活处理（例如S/D法处理或巴氏消毒处理）的产品，可通过纳米膜过滤或100℃干热处理30 min进行第二步病毒灭活/去除处理。

考虑到其除去小型病毒（包括人细小病毒B19）的能力，只要可行，15～19 nm纳米膜过滤是较好的选择。这种选择的另一个好处是对蛋白质结构影响不大，从而限制了产生新抗原的风险。新抗原可能使患者产生抗凝血因子抗体。15～19 nm纳米膜过滤已成功应用于人凝血因子Ⅸ、人凝血因子Ⅺ、人凝血因子Ⅷ等制品，特别是当这些制品被高度纯化并且有接近1 g/L的总蛋白含量时。高纯度vWF只能用35 nm孔径膜进行纳米膜过滤，因其几百万道尔顿的高分子多聚体很难通过更小孔径的纳米膜滤器。在大多数情况下，纳米膜过滤是对最终纯化蛋白组分进行过滤，之后及时进行除菌过滤、无菌灌装及冷冻干燥，从而避免下游病毒污染的风险。

干热处理是备用的第二步病毒灭活处理，可与S/D法处理组合。但是，它对人细小病毒B19的灭活作用有限。此外，人凝血因子Ⅷ和人凝血因子Ⅸ制品通常会损失15%～20%的活性。其优势是对无菌灌装后的产品进行处理，避免了下游病毒污染的风险。