凝血因子制备：结构稳定性和含量决定制品质量

凝血因子类制品的制备是由它们的结构和在血浆蛋白组成中的含量决定的。与白蛋白、球蛋白比较，各凝血因子均表现出较差的结构稳定性，而且在血浆中的含量较低。这就要求选择比较温和而且分离效率较高的纯化方法。因此，在这类浆源蛋白制品的制备中，层析法广泛地用作关键的纯化方法。限于篇幅，本节根据国内外现状重点介绍常规层析法制备工艺，也提及免疫亲和层析法制备工艺，以人凝血因子Ⅷ为例。

人凝血因子Ⅷ是从人血浆分离出来的、以凝血因子Ⅷ（F Ⅷ）为主要药物成分的血浆蛋白制品。凝血因子Ⅷ纯度是人凝血因子Ⅷ制备中的一个重要指标。在不同文献中，对其纯度高低的判断不同。在本节中，将1 IU/mg≤比活＜10 IU/mg的制品称作低纯制品，将10 IU/mg≤比活＜50 IU/mg的制品称作中纯制品，将50 IU/mg≤比活＜100 IU/mg的制品称作高纯制品，将比活≥100 IU/mg的制品称作超高纯制品。

一个高品质的人凝血因子Ⅷ，不仅应当有高的纯度，也应当有最少化的不利杂质。由于多种凝血因子与凝血因子Ⅷ在理化性质上的相近性，人凝血因子Ⅷ的制备尤其要关注杂蛋白中某些凝血因子（例如Fg）的共存程度。此外，在血浆采集、储运和凝血因子Ⅷ生产过程中，均可能产生凝血因子的激活和目标蛋白凝血因子Ⅷ的凝血活性失活。通常，在关键生产环节、半成品和成品中均要针对性地监测这类反应。检出失活的方法有检验活性抗原比（Ⅷc/Ⅷ∶Ag）。检出激活的方法较多，例如检验可疑的激活凝血因子（例如Th）、蛋白酶等。

从人血浆直接分离凝血因子Ⅷ的研究很多。但目前主要的生产工艺仍是以人血浆冷沉淀为原材料制备人凝血因子Ⅷ。尽管以冷沉淀为原材料，但血浆的采集、储运对人凝血因子Ⅷ的制备具有特别重要的意义。例如，在一般制备过程中，对血浆进行某些处理（例如加入肝素钠等）有助于提高回收率。人凝血因子Ⅷ的制备中，可供选择的纯化方法较多，其主要机制包括沉淀分离（例如甘氨酸沉淀）、无机盐吸附分离（例如氢氧化铝吸附）、离子交换层析分离、亲和层析分离等。选择适当的制备方法，是获得高回收率及高品质产品的保证。

（一）沉淀法

沉淀法是制备人凝血因子Ⅷ的最早和最简单的方法。在实际生产中，PEG（聚乙二醇）沉淀法、甘氨酸沉淀法、酸沉淀法是使用较多的方法。

基于沉淀法的人凝血因子Ⅷ，均为低纯或中纯制品，含有较多的纤维蛋白原、纤维结合蛋白、IgM和IgG等杂蛋白，凝血因子Ⅷ含量不到总蛋白的1%。杂蛋白含量过高，有可能导致一系列免疫异常或过敏反应的发生。尽管沉淀法有简单、快速、经济的优点，由于其纯化效率较低，且与S/D法病毒灭活处理的相容性较差，作为一种独立的制备方法现在已越来越没有吸引力。

（二）离子交换层析法

常规的离子交换层析法纯化效率较高，且与S/D法病毒灭活处理的相容性较好，是目前工业上使用较多的一种人凝血因子Ⅷ制备方法。

上述工艺主要包括以下步骤：

（1）取冷沉淀。(www.xing528.com)

（2）冷沉淀抽提液的处理：制备冷沉淀抽提液，进行氢氧化铝吸附，离心分离，对上清液进行S/D法处理。

（3）层析纯化：将S/D法处理后的上清液上DEAE-Fractogel TSK 650M柱，再经平衡液（0.1 mol/L NaCl溶液）平衡、洗涤液（0.15 mol/L NaCl溶液）洗涤、洗脱液（0.25 mol/L NaCl溶液）洗脱。

（4）后处理：0.25 mol/L NaCl溶液洗脱组分经超滤脱盐和浓缩后，进行配制和除菌过滤，再分装和冻干，即获得冻干人凝血因子Ⅷ。

为了进一步改进制品的病毒安全性，可在后处理中增加纳米膜过滤法或（和）干热法步骤。

（三）免疫亲和层析法

随着单克隆抗体技术的发展，免疫亲和层析法在人凝血因子Ⅷ制品的制备中得到了工业应用。该方法可以分为两类。

（1）一次层析法：将vWF的McAb（单克隆抗体）偶联至凝胶亲和层析柱。将冷沉淀溶解液上柱分离。在洗出杂蛋白后，用高浓度Ca2+将凝血因子Ⅷ洗脱。

（2）两次层析法：将凝血因子Ⅷ：c的McAb偶联至凝胶亲和层析柱。将冷沉淀溶解液上柱分离。在洗出杂蛋白后，洗脱含凝血因子Ⅷ的组分。该组分进一步经离子交换层析，除去可能混杂的McAb，从而制得高比活性人凝血因子Ⅷ。

在亲和层析过程中，难免有抗体从亲和柱上释出，因而亲和柱使用寿命不长。此外，存在鼠IgG污染的风险。