人免疫球蛋白的制备方法优化

（一）低温乙醇法制备工艺

（1）Cohn 9法：人免疫球蛋白制备的经典方法是低温乙醇法。1949年报道的Cohn 9法，又称Oncley法，它以Cohn 6法的组分Ⅱ+Ⅲ为起始原料，经一系列沉淀反应步骤，得到组分Ⅱ。Cohn 9法分离过程中也是通过系统地改变低温乙醇法的五因素，影响不同类蛋白质的溶解度，最终分离制备人免疫球蛋白。

（2）Kistler-Nitschmann法：Kistler-Nitschmann法制备人免疫球蛋白的起始原料为组分A，相当于Cohn 6法的组分Ⅱ+Ⅲ。

（3）低温乙醇法/压滤法工艺：在低温乙醇法/压滤法工艺中，已使用压滤技术代替离心机，并对工艺参数进行了相应的调整，使蛋白质回收率及外观质量得到进一步提升，制品质量也更加稳定。以低温乙醇法作为沉淀技术、以压滤法作为沉淀分离技术的制备方法可简称为低温乙醇法/压滤法工艺。

（二）层析法制备工艺

Suomela等描述了小规模离子交换层析分离免疫球蛋白的方法：经预处理的血浆被引入平衡过的DEAE-Sepharose CL-6B柱，免疫球蛋白不被吸附，而白蛋白和α球蛋白、β球蛋白被吸附；流出的免疫球蛋白溶液通过第二柱Lysine-Spharose 4B吸附去除纤溶酶原；再将第二柱的流出液调pH至5.8后加入SP-Spharose 4B柱，使免疫球蛋白吸附在柱上，再使用pH 11的甘氨酸溶液从第三柱上洗脱免疫球蛋白。此方法分离免疫球蛋白的纯度近100%，IgG聚合体含量较低。

Gebauer等在制备人免疫球蛋白时，采用有机溶剂/表面活性剂法（S/D法）灭活脂包膜病毒。为了去除有机溶剂（S）和表面活性剂（D），进一步引入了离子交换层析。在离子交换层析过程中，免疫球蛋白结合于Q-Sepharose FF，而有机溶剂/表面活性剂随平衡液流出，然后通过增加洗涤液的离子强度将免疫球蛋白洗出。所得免疫球蛋白中有机溶剂的含量小于2 μg/mL，去污剂的含量小于10μg/mL。

（三）辛酸沉淀法/层析法制备工艺(www.xing528.com)

以下简要介绍Habeed等于1984年发表的一种辛酸沉淀结合层析技术分离纯化免疫球蛋白的方法。

（1）原料血浆用2倍量的0.06 mol/L醋酸盐缓冲液稀释，再用1 mol/L的醋酸溶液调节pH至4.8。室温下缓慢加入辛酸，继续搅拌20 min。然后用1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至溶液变澄清。用0.015 mol/L醋酸钠溶液（pH 5.7）透析3次，然后加入DEAE-纤维素，于4℃搅拌3h，过滤。

（2）将过滤收集的层析凝胶装柱，用0.015 mol/L醋酸钠溶液（pH 5.7）预洗，再用含有0.2 mol/L NaCl的0.0175 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.2）洗脱。

（3）洗脱液浓缩，再用0.005 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 6.2）透析3次，得到免疫球蛋白粗品（为了提高病毒安全性，此处可用S/D法处理）。

（4）粗品上DEAE-纤维素柱，用0.005 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.2）平衡，再用含有0.5 mol/L NaCl的0.0175 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.2）进行梯度洗脱。

（5）洗脱液用0.01 mol/L碳酸钠溶液透析3次，然后冻干，得免疫球蛋白。