人血清白蛋白的制备方法

将人血清白蛋白从人血浆中分离出来曾使用过多种方法，目前主要使用低温乙醇法，少数情况下使用层析法。人血清白蛋白制备方法的比较如图8-2所示。

图8-2　人血清白蛋白制备方法的比较

注：图中由左向右6种制备方法分别是Hink法（1957年）、Cohn法（1946年）、Kistler-Nitschmann法（1962年）、Zenalb法（1991年）、CSLAlbumex Process法（1990年）、Bergloff法（1983年）。其中，BEC为缓冲液交换层析；AEC为阴离子交换树脂；CEC为阳离子交换树脂；GFC为凝胶过滤层析。

（一）低温乙醇法制备工艺

1.Cohn法　血浆蛋白分离纯化的经典方法是由美国的E.J.Cohn等开发的Cohn低温乙醇工艺，具有重要的历史地位。本方法经过多次改良，其中1946年报道的Cohn 6法是主要用于分离人血清白蛋白的经典方法。在Cohn 6法分离的过程中，主要通过系统地选择低温乙醇法的五因素影响不同蛋白质的溶解度，形成不同的沉淀反应，以获得含有不同蛋白质成分的众多组分（表8-3）。

表8-3　Cohn 6法各组分中血浆蛋白分布情况

Cohn 6法奠定了分离人血清白蛋白和免疫球蛋白的基础，但是该法存在分离步骤较多、分离周期长、白蛋白等蛋白质回收率较低以及加入53.3%乙醇溶液使待分离容积较大的问题。这些问题引起了众多致力于规模化分离血浆蛋白的科学工作者的注意，他们在力求简化分离步骤、减小分离容积、提高回收率等方面进行了大量的研究工作，也提出了一些改良方法。例如一种仍在使用的Cohn 6法的改良法，其采用组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ一步沉淀以减少工艺步骤。(www.xing528.com)

2.Kistler-Nitschmann法　目前国际上常用的低温乙醇血浆蛋白分离法均是Cohn法的改进法，包括两种，即6+9法（又称Cohn-Oncley法）和Kistler-Nitschmann法。国内生产单位亦分别采用这两种方法或它们的改进法。

Kistler-Nitschmann法制备人血清白蛋白的工艺中，各沉淀反应所生成组分中的蛋白质分布情况如表8-4所示，其组分A、组分C、组分GG和组分B分别与Cohn 6法的组分Ⅱ+Ⅲ、组分Ⅴ、组分Ⅱ和组分Ⅲ相对应。

表8-4　Kistler-Nitschmann法各组分中血浆蛋白的分布情况

3.Hink法　为了一些临床治疗的需要，人们分离制备了一种与血液等渗的被称为血浆蛋白组分（plasma protein fraction，PPF）的制品，它在一定程度上可以替代人血清白蛋白。世界卫生组织规定这种制品中白蛋白成分应占蛋白质总含量的83%以上，其他成分包括α球蛋白、β球蛋白和盐分，γ球蛋白含量必须小于1%。Hink等首次描述了大规模分离PPF的方法。这一方法取消了沉淀组分Ⅳ-4的步骤，而将沉淀组分Ⅳ-4和组分V通过一个简单的步骤完成。因此，此方法比人血清白蛋白的分离步骤简单、经济，可获得高回收率。另外，Mealey等报道了改变Cohn 6法的条件制备高稳定的PPF，获得了较好的回收率。

4.低温乙醇法/压滤法工艺　在低温乙醇工艺中，固液相分离是非常重要的步骤。此前，对蛋白悬液的分离大多采用低温连续离心法。受流体力学相关因素（如流体加速度、剪切力等）的影响，蛋白质回收率比较低，制品质量欠佳。随后使用压滤技术代替离心机，并对工艺参数进行了相应的调整，可使蛋白质回收率及外观质量得到进一步提升，制品质量也更加稳定。以低温乙醇法作为沉淀技术、以压滤法作为沉淀分离技术的制备方法可简称为低温乙醇法/压滤法工艺。

（二）层析法制备工艺

尽管低温乙醇法已被广泛应用，但其仍然存在产品纯度不够高、操作环境不够友好、乙醇溶剂易燃易爆等诸多缺陷。随着技术的不断进步，离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析、膜色谱技术被越来越多地用于人血清白蛋白的生产。

层析技术目前已形成一定的规模。含层析法的人血清白蛋白制备工艺包括以下三种：①层析法与乙醇工艺结合；②低温乙醇法结合其他方法后再与层析法结合；③直接自血浆开始，多步层析生产人血清白蛋白。总体而言，层析技术使蛋白质回收率、纯度以及自动化程度提高，也使得人血清白蛋白制品的质量和安全性进一步得到改进。