目的基因HSA是人工合成的，在其5'端和3'端分别加上了SchⅠ和XhoⅠ酶切位点，并在目的基因的上游添加一段1241 bp长的Gt13a启动子和信号肽序列（GenBank：AP003256）。该序列是从水稻基因组TP309中获取的，这样可以充分利用水稻基因密码子的偏好性来有效表达HSA基因。
农杆菌双元载体将合成的HSA基因用Sch Ⅰ和XhoⅠ双酶切，并克隆进经NaeⅠ/XhoⅠ酶切的质粒pOsPMP0 1，得到重组质粒pOsPMP04。同时，为了构建根瘤农杆菌双元载体，用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切pOsPMP04，将得到的2832 bp的片段克隆进双元载体pCambia1301，得到的重组载体命名为pOsPMP0114，并将其导入根瘤农杆菌EHA105中。
（二）农杆菌介导的共转化
将pOsPMP114和pOsPMP2通过农杆菌介导转化从水稻品种TP309中分离得到的愈伤组织。
（三）共转化的检测
用PCR方法鉴定成功转化的愈伤组织。
PCR程序：94℃变性5 min，随后，进行94℃30s，58℃30s和72℃45s，共30个循环。所有PCR阳性植株在温室中培育至成熟。
（四）OsrHSA的定量测定
在提取液（50 mmol/L Tris（pH 8.0），100 mmol/L NaCl）中研磨种子，12000g离心10 min取上清液，得到水稻种子蛋白粗提液。其中，蛋白浓度用BCA方法测定。HSA的定量检测用人HSA ELISA定量试剂盒，测定流程按试剂盒说明书进行，计算水稻种子中OsrHSA的含量。
（五）从水稻种子中纯化OsrHSA的方法
将水稻种子研磨成粉，然后用磷酸盐缓冲液（PBS）（25 mmol/L PB，50 mmol/L NaCl（pH 7.5））在室温下匀浆抽提1h，然后，用醋酸调节pH至5.0，沉淀2h。粗提物离心（12000g，10 min）。大规模纯化时，此步骤可以采用压滤。上清液用pH 5.0进样层析柱Capto-MMC（GE Health）进行纯化，用PBS（25 mmol/L PB，100 mmol/L NaCl（pH 7.0））进行洗脱。Capto-MMC是阳离子交换介质，HSA被吸附在层析介质上，细胞碎片及部分杂质不被吸附，直接流出。收集洗脱液，调节pH为7.5，然后用Q Sepharose Fast Flow（GE Health）进一步纯化，以PBS（25 mmol/L PB，50 mmol/L NaCl（pH 7.5））进行洗脱。Q Sepharose Fast Flow为阴离子交换介质，用于除去抗原类物质、碳水化合物和色素等。含OsrHSA的洗脱液再用Phenyl HP（GE Health）层析纯化，洗脱液为0.45 mol/L（NH4）2SO4。Phenyl HP是疏水相互作用介质，用于除去非抗原性的碳水化合物（包括戊糖、己糖、低聚糖等）和部分色素。含OsrHSA的洗脱液再以Pellicon（Millipore）进行脱盐和浓缩。整个分离纯化过程约需48 h。(www.xing528.com)
从水稻种子中纯化OsrHSA过程的主要步骤（图6-6）包括研磨、提取、层析分离、脱盐与浓缩、冻干等过程，需3天。
图6-6 从水稻种子中纯化OsrHSA的主要步骤
规模化纯化的收率为55.75%±3.19%；转基因水稻呈棕色，OsrHSA的表达量达到2.75 g/kg。
（六）OsrHSA的纯度分析
（1）电泳分析：采用SDS-PAGE方法。
（2）HPLC分析：采用TSK3000柱对终产品进行分析检测，流动相为PBS（50 mmol/L PB，0.3%NaCl，pH 6.5），流速为1 mL/min。
（七）无菌分装
经过上述分离纯化的OsrHSA纯度可达99.9%以上，可进行制剂。采用的剂型为水溶液，将上述提纯的OsrHSA进行无菌过滤，分装包装，即得到利用水稻进行基因重组生产的HSA。利用这种转基因水稻制备的HSA与人血浆来源的HSA的理化性质、免疫性、体内外有效性均等同，而且，其产量比其他表达体系和同类技术体系均高10～1000倍，成本相当于酵母或细菌成本的2%～10%，相当于动物细胞培养的0.01%～0.05%，并且在一年内即可获得千克级的rHSA，无动物源病毒等污染风险，水稻原料生产能耗为酵母的1/28，二氧化碳和污水零排放。待该技术实现产业化后，可使我国HSA紧缺问题得以解决，还能保障其安全应用，将来，待其产业规模不断扩大后，也有望满足全球对HSA的需求。
附
缩略表
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