影响悬浮细胞培养与紫杉醇代谢的因素分析

（一）外植体

云南红豆杉和中国红豆杉茎段形成的愈伤组织，其紫杉醇含量普遍比东北红豆杉和杂种红豆杉高。同种红豆杉单株紫杉醇含量也存在差异，如云南红豆杉的单株差异可达10倍，说明紫杉醇含量存在基因型的差异。

（二）培养基

细胞培养与愈伤组织培养所用的培养基组成基本一致，只是细胞培养为液体培养基。多数采用B5培养基，也有的采用MS培养基。B5培养基对细胞生长较适宜，而MS培养基有利于紫杉醇的产生。悬浮培养中使用的碳源多为蔗糖，细胞正常生长最适的蔗糖浓度为20 g/L，但高浓度的蔗糖可提高次生代谢产物的产量。如B5培养基中加30 g/L蔗糖，在悬浮培养后期，仍因碳源缺乏而限制细胞生长，需补充碳源。氮和磷则基本满足了培养的要求。激素的种类与使用比例对于不同种的红豆杉不同。单独使用低浓度的2，4-D（0.5～1.0 mg/L）更适合紫杉醇的合成，而较高浓度的2，4-D（1.0～2.5 mg/L）则较适合细胞的生长；使用NAA时，紫杉醇的产量变化与使用2，4-D的结果相差不大；而使用IAA时，它比2，4-D更能有效地提高紫杉醇的产量。KT和6-BA单独使用均不能促进细胞生长，但6-BA在缓解褐变上有一定作用。因此，合理使用植物激素对细胞培养十分重要。如中国红豆杉细胞培养中，细胞生长时2，4-D、NAA、6-BA的最适配比为0.23∶1∶0.62，KT与2，4-D为1∶（5～10），此时紫杉醇含量达较高水平。

（三）培养基中添加前体物和有机附加物

一些氨基酸等小分子物质与紫杉醇的分子结构有关，如苯丙氨酸参与紫杉醇分子侧链的合成，苯甲酸本身即是侧链的一个组成成分。因此，在细胞培养液中加入苯丙氨酸、苯甲酸、苯甲酰甘氨酸和丝氨酸都能显著提高紫杉醇的产量。另外，培养基中加入适当浓度的有机附加物，如椰子汁、水解酪蛋白、水解乳蛋白，可增加细胞的生长量及紫杉醇的含量。

（四）培养基中添加诱导子(www.xing528.com)

植物次生代谢产物的合成具有多条代谢途径，通过改变培养条件，可以定向诱导目的产物的合成。在植物细胞的培养中引入诱导子，一般可提高次生代谢产物的产量，同时促进产物分泌到培养基中。近十几年来，利用诱导子提高植物培养细胞中目的产物含量一直是国内外研究的热点，研究较多的是真菌诱导子、茉莉酸甲酯诱导子、水杨酸诱导子、铜离子诱导子等。茉莉酸甲酯对培养物中紫杉醇含量的增加具有明显的促进作用，而且对紫杉醇的一系列前体物质及其类似物的含量均有较大影响。水杨酸作为一种重要的细胞信使与植物抗毒素，可以诱导呼吸方式从细胞色素呼吸途径到交替呼吸途径的转变，为植物病理反应提供物质、能量以及信号转导的基础，红豆杉细胞培养时加入水杨酸可诱导紫杉醇的大量合成。Cu2+可强烈地促进一些次生代谢产物的合成，如CuCl2可作为若干次生代谢产物的非生物诱导子。Cu2+诱导处理可能促进细胞内与紫杉醇合成相关的酶的合成，且在细胞指数生长末期诱导效果最佳。如中国红豆杉细胞悬浮培养中添加CuCl2，可促进紫杉醇的形成。真菌诱导子是来源于真菌的一种确定的化学信号，在植物与真菌的相互作用中能够快速高度专一和选择性地诱导植物特定基因的表达，进而活化特定的次生代谢途径，积累特定的目标产物。如南方红豆杉细胞悬浮培养过程中，在细胞指数生长末期加入真菌诱导子（来源于尖孢镰刀菌（Fusarium arysporum），主要成分为糖和多肽），能够调控细胞的次生代谢，使次生代谢途径中一些重要的酶被合成或其活力得到提高，一些特定的次生代谢途径，如苯丙烷类代谢途径和萜类代谢途径得到活化，最终导致目标产物紫杉醇产量的明显提高。

（五）接种量

细胞接种量不应低于2 g/L（干重），细胞生长速率在接种量为6 g/L时达最高，此后便开始下降，因此，细胞接种量以5～8 g/L为宜。

（六）培养条件

培养基的pH在5～7时对细胞产量影响不大；黑暗条件下细胞生长速率约为光照条件下的3倍，紫杉醇的产量也约为光照下的3倍；培养液中气体成分也影响细胞悬浮培养生产紫杉醇的时间和产量，合适的气体组成和比例为氧气∶二氧化碳：乙烯为10∶0.5∶（5×10-4）。

目前，所有见诸于报道的红豆杉植物均可诱导形成愈伤组织，产紫杉醇能力在各品种红豆杉中趋于稳定（1～3 mg/L，相对于209 g干树皮的含量），因此通过天然的筛选恐难以实现紫杉醇合成效率的突破。随着对紫杉醇合成代谢调控以及基因工程方面的深入研究，通过基因改良技术，人为控制相关合成途径的表达与调控，可实现紫杉醇的高效率生产。在现有红豆杉细胞系中，实验室级别的悬浮培养条件研究成果十分丰富，而扩大化培养系统方面的研究除了Srinivansan对紫杉醇生物合成有过大规模培养研究外，尚无结果较为理想的报道。因此，如何成功完成放大培养，是实现红豆杉细胞培养生产紫杉醇产业化需要克服的困难。在此方面，主要难题包括以下几点：①紫杉醇的低水平表达；②紫杉醇的水溶性低；③长时间培养后，紫杉醇含量会降低；④紫杉醇的胞外释放率低；⑤细胞对剪切力耐受力低；⑥紫杉醇的生产稳定性。只有解决了上述难题，才能实现此途径紫杉醇生产的产业化。