红豆杉愈伤组织的诱导方法探究

（一）外植体的选择与处理

用于诱导愈伤组织的外植体很多，如种子、雌配体、根、树皮、形成层、茎段、叶和芽等，一般选择紫杉醇含量高的外植体，如幼茎树皮，以幼茎效果最好。

幼茎外植体的处理方法：取新生的幼茎，清水漂洗后，在超净台上用70%乙醇浸泡0.5～1 min，无菌水冲洗3次，5%次氯酸钠浸泡5～8 min，无菌水清洗3～5次，无菌滤纸吸取材料表面水分，接种在培养基上。

用于愈伤组织诱导和继代培养的培养基有多种，主要是MS、B5、White、SH等培养基。因品种和取材部位不同，所用培养基的种类也不相同。多数研究表明，适合于愈伤组织诱导的培养基为MS、B5，且MS培养基比较适宜愈伤组织的生长。基本培养基中添加的外源激素主要为2，4-D、NAA、KT，浓度分别为1.0～2.0 mg/L、1.0 mg/L、0.1～0.25 mg/L。其中，NAA更有利于愈伤组织的形成。另外，培养基中加入LH（2000 mg/L），可提高愈伤组织的诱导率，添加10%的椰子汁可提高愈伤组织的生长势和诱导率。继代培养时，细胞向培养基中分泌一些酚类化合物，导致细胞褐变和生长缓慢，可在培养基中加入活性炭或聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、植酸等，防止褐变发生。

诱导愈伤组织培养基的pH为5.5～6.0，继代培养基的pH为4.8～7.8。如东北红豆杉愈伤组织培养时，pH为7.0左右时愈伤组织生长情况最好，但其次生代谢产物产量却远低于pH 6.0组。光培养条件下，愈伤组织结构紧密，生长较慢，易再分化出芽和根；暗培养下，愈伤组织结构分散，生长较快，但不能分化出芽，较难分化出根，但暗培养的愈伤组织诱导率高于光培养。适合愈伤组织诱导的培养温度为20～26℃，继代培养温度为24～26℃。

（二）红豆杉悬浮细胞培养(www.xing528.com)

悬浮细胞培养是通过将愈伤组织接种在液体增殖培养基中，在摇床上振荡培养建立起来的。将灭过菌的液体培养基装入250 mL或500 mL三角瓶中，取培养15～20天生长良好的细胞，接种于液体培养基中，置旋转摇床上，在25℃、120～130 r/min的条件下培养。如云南红豆杉细胞培养18～21天时，紫杉醇产量达到最大。在细胞悬浮培养过程中形成大小不等的细胞团，细胞团从外向里具有明显的3个区域：①表层细胞，含大量的淀粉颗粒；②中层细胞，由增殖能力旺盛的细胞组成；③中心细胞，该区域出现分化现象。

（三）细胞收集与干燥

离心或过滤收集细胞，用去离子水洗涤2～3次，每次抽干，然后，于30～40℃真空干燥，得到红豆杉培养细胞成品。

（四）分离纯化

采用超临界提取，然后用己烷脱脂，氯仿萃取。随后用制备型HPLC方法进行进一步纯化即得。