转基因细胞的细胞核移植和后代扩繁分析

奶山羊经同期发情和超排处理，获得体内成熟的卵母细胞和寄母羊。阳性转基因细胞在含0.5%胎牛血清的DMEM-F12培养基中饥饿培养2～5天后，在M2中移入去核卵母细胞的卵周隙内，用电刺激的方法将供核细胞与去核卵母细胞融合，体外培养4h后，用5μmol/L离子霉素激活5 min，再在含有2 mmol/L的6-甲基苯胺嘌呤培养基中培养5h。共进行三批转AT Ⅲ基因的克隆操作，供核细胞与去核卵母细胞的融合率为81%～91%。最后，克隆胚胎移入M16中培养；第二天，克隆胚胎移入寄母羊输卵管中。寄母羊怀孕，产出5只克隆羊，移植胚胎出生率只有1%～2%。采用Southern和PCR检测克隆后代的转基因，表明5只元代克隆羊均含有AT Ⅲ基因。

由于所得到的5只克隆羊的转基因拷贝数和转基因整合位点都不一致。因此，5只转基因克隆羊需要分别与崂山奶山羊种羊交配，获得转人AT Ⅲ基因的后代，转基因后代母羊再进行交配、产子，获得转基因乳汁。(www.xing528.com)

DNA的制备和转基因分析操作方法：将培养的细胞和少量克隆羊的组织转入DNA裂解液（含有蛋白酶K）中，在55℃水浴锅中放置过夜，然后加入两倍的无水乙醇，混匀，离心；用70%的乙醇洗DNA一次，自然干燥，然后加入适量的TE（TRIS-EDTA）溶液，待DNA全部溶解后，放入-20℃的冰箱中。加入Pst Ⅰ酶消化DNA，过夜。然后，取样在0.8%的琼脂糖凝胶中电泳，再将DNA转入纤维膜中，用32P标记探针进行杂交，获得DNA的Southern图片。用引物对细胞和克隆羊的DNA进行PCR扩增。获得PCR产物后进行凝胶电泳，然后拍照。