细胞工程的历史与发展

细胞工程的理论基础是细胞学说和细胞全能性学说，其发展可以追溯到19世纪。总体来说，细胞工程的发展可分为三个时期，探索时期、培养技术建立时期和迅速发展与应用时期。

（一）探索时期以及培养技术建立时期

（1）植物细胞工程的发展。

在Schleiden（1838年）和Schwann（1839年）所提出的细胞学说的推动下，20世纪初，德国植物学家Haberlandt（1902年）首次进行了离体细胞培养试验，并提出高等植物的体细胞可以不断分割，直至单个细胞的说法。在1910年前后，植物组织培养工作受动物血清培养技术的影响，以植物组织液作为培养基的研究获得了可喜的进展。1922年，美国的Robbinst和德国的Kotte分别报道了在含有无机盐、葡萄糖和多种氨基酸的培养基中离体培养豆、玉米、棉花的根尖、茎尖获得成功，这是有关茎尖培养成功的最早试验。1929年Laibach把亚麻科种间杂交形成的不能成活的种子中的胚剥出，在人工培养基上培养至成熟，从而证明了胚培养在远缘杂交中应用的可能性。

1934年，Gautheret在山毛柳和黑杨等形成层组织的培养中发现了B族维生素和IAA（indole-3-acetic acid，吲哚-3-乙酸，最初称为异植物生长素）的作用，揭示了B族维生素和生长素的重要意义。1937年，White通过研究B族维生素对离体根生长的重要性，发明了White培养基。1939年，Nobecourt用胡萝卜建立了连续生长的组织培养基本方法，成为以后各种植物组织培养的技术基础。因此Gautheret、White和Nobecourt三人被誉为植物细胞工程学的奠基人。20世纪40—50年代，Skoog（1944年）和我国的崔澂（1951年）发现腺嘌呤或腺苷不仅可以促进愈伤组织的生长，而且可以解除IAA对芽形成的抑制作用，并诱导成芽，从而确定了腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。随后，植物细胞工程的发展日益繁荣。1952年，Morel和Martin通过培养大丽花茎尖获得了脱毒植株。1954年Muir在液体培养基及滤纸中进行单细胞培养获得成功。1957年，Skoog和Miller提出了改变生长素与细胞分裂素的比例可以控制组织培养中根和茎的分化。1958—1959年，Reinert和Steward分别报道在胡萝卜愈伤组织培养中获得了体细胞胚，并获得了再生植株，这是人类第一次获得人工体细胞胚，同时也证明了植物细胞的全能性。这是植物细胞工程的第一个突破，它对植物组织和细胞培养产生了深远的影响。

（2）动物细胞工程的发展。

动物细胞工程的发展相对植物细胞工程晚了几年。1907年，美国胚胎学家Ross Harrison采用盖玻片悬滴培养法，观察到了蛙胚神经细胞突起的生长过程，并开创了动物细胞体外培养的先河。1912年，Carrel把外科无菌操作的概念和方法引入组织培养中，并将鸡胚心肌组织原代细胞进行了长期的传代培养。之后，Carrel于1923年发明了卡氏培养瓶。1925年，Maximow改良了悬滴培养法，建立了双盖玻片法。Strangeway于1926年设计了表面皿培养法，从此动物细胞培养技术基本建立起来。

20世纪40年代末开始，动物细胞工程技术的研究迎来了迅猛发展。1948年，Sardord创立了分离细胞培养法，第一次成功地从单层细胞中分离出单个细胞，使建立遗传性状相同的细胞株成为可能。1953年，Gay以人的肿瘤组织为材料成功创建了Hela细胞系。1958年，Okada用高浓度的灭活仙台病毒在体外成功融合了小鼠艾氏腹水肿瘤细胞，创建了人工细胞融合技术，同时也带动了植物细胞间的融合。1962年，Capstick等首先成功地进行了仓鼠肾细胞的大规模悬浮培养，这是动物细胞培养用于大规模工业生产的突破性进展。

总之，在这一发展阶段中，人们通过对培养条件和培养基成分的广泛研究，已经实现了对离体细胞生长和分化的控制，从而初步确立了植物细胞工程、动物细胞工程的技术体系，为随后的发展奠定了基础。

（二）迅速发展与应用时期

因为有了上述理论和技术基础，20世纪60年代以后，细胞工程技术进入快速发展与应用时期。植物细胞工程与常规育种遗传工程、发酵工程等技术相结合，广泛地应用于生产实践；动物细胞工程也随着细胞培养原理与方法的完善以及微载体培养技术的发展得到了迅速发展，大规模培养的动物细胞已被应用于疫苗、干扰素和单克隆抗体等的规模化生产。

（1）植物原生质体培养取得了重大突破。

1960年，英国科学家Cocking等用纤维素酶分离植物原生质体获得成功，建立了植物原生质体培养和体细胞杂交技术，这是植物细胞工程的第二个突破。1971年，Takebe等在烟草上首次由原生质体培养获得了再生植株。这不仅在理论上证明了除体细胞和生殖细胞以外无壁的原生质体也同样具有全能性，而且在技术上也为外源基因的导入提供了理想的受体材料。1980年，Vasil等利用珍珠谷的胚性悬浮细胞游离得到原生质体，并成功地通过胚胎发生途径再生得到小植株，标志着禾本科植物原生质体培养的重大进展。1972年Carlson等通过两个烟草物种之间原生质体融合获得了第一个体细胞杂种。1978年番茄与马铃薯原生质体融合获得了再生植株。原生质体培养的成功，进一步促进了体细胞融合技术的发展。

（2）花药培养取得显著成绩。

1964年Guha和Maheshwari成功地将毛叶曼陀罗花药培养成花粉单倍体植株。由于单倍体在突变选择和加速杂合体纯化过程中具有重要作用，此项技术大大促进了该领域的发展。目前获得成功的植物种类达160余种，如烟草、水稻、小麦等的单倍体育种在中国已经取得了引人注目的成就。

（3）植物脱毒及无性快速繁殖技术得到广泛应用。

1960—1964年，Morel培养兰花茎尖，用以脱除病毒并能快速繁殖兰花。由于这种方法有巨大的实用价值，很快被兰花生产者所采用，国际上迅速建立起“兰花工业”。在“兰花工业”高效益的刺激下，植物离体快速繁殖的脱毒技术得到了迅速发展，实现了试管苗产业化，并取得了巨大的经济效益。(www.xing528.com)

（4）植物细胞次生代谢产物的生产。

1967年，Kaul和Staba采用发酵罐在对小阿米（Ammi visnaga）的细胞进行培养中首次得到了药用物质呋喃色酮。1983年，日本先后实现紫草培养生产紫草宁以及黄连培养生产小檗碱的工业化规模，并以紫草宁作为天然色素用于口红、肥皂等日用化工产品生产中。我国学者在此领域内亦取得许多研究成果，如人参细胞、三分三细胞、三七细胞的发酵培养以及九连小檗、西洋参、当归、青蒿、紫背天葵、延胡索、红豆杉等植物细胞培养的研究工作。

近年来，利用植物细胞大规模培养以提取有用次生代谢产物的研究并没有像人们所预计的那样广泛地进入工业化生产，主要是因为细胞培养的成本太高。越来越多的研究者已把工作重点转移到以细胞生物学和分子生物学为基础的次生代谢产物的产量提高及成本的降低方面，如植物细胞的固定化培养、分子水平次生代谢调控的研究、诱导子的广泛应用及发状根的培养等。目前，各国竞相开发一批具有重要药用价值的植物次生代谢产物，如紫杉醇、长春新碱、小檗碱等，有些已开始进入工业化生产阶段。

（5）植物细胞离体保存技术大大发展。

植物种质资源保存是世界性重要课题，对拯救珍贵、濒危物种及环境保护有重大意义。利用离体组织培养技术，对茎尖分生组织等离体材料进行超低温保存，不但可以大大节省空间，而且不受季节限制，便于无毒种质的国际交换。我国目前已在多处建立了植物种质离体保存地点。

（6）基因转化技术及生物反应器的发展。

在植物细胞方面，1980年Davey等用Ti质粒转化原生质体成功。1983年，Zambryski等用根癌农杆菌转化烟草，在世界上获得了首例转基因植物，使农杆菌介导法很快成为双子叶植物的主导遗传转化方法。Horsch等于1985年建立了农杆菌介导的叶盘法，开创了植物遗传转化的新途径。1987年，美国的Sanford等发明了基因枪法，克服了农杆菌介导法对单子叶植物遗传转化困难的缺陷。在20世纪90年代，农杆菌介导法在单子叶植物的遗传转化上取得突破性进展，在玉米、水稻、大麦、小麦等上先后实现了高效转化。目前，转基因抗虫棉、抗虫玉米、抗虫油菜、抗除草剂大豆等一批植物新品种已经被大面积推广种植。利用植物生物反应器生产的药物、色素、食品添加剂、农药等活性物质已达300多种，为农业生产带来巨大效益。

从分子生物学技术上看，植物和动物细胞并没有太大差异，所以动物细胞工程也在20世纪后半叶几乎同时发展起来。第一只转基因动物是Gordon通过向小鼠的单细胞胚胎的原核注射纯化的DNA后获得的。1983年Palmiter和Brinster将大鼠生长激素基因转入小鼠，生产出生长速度极快的超级小白鼠。这一时期，乳腺生物反应器的研究取得了快速发展。1987年Gordon构建了分泌组织型纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，tPA）的转基因小鼠。随后数年内，多种乳腺生物反应器（如羊、猪、牛）相继研究成功。利用乳腺生物反应器生产出多种生物药物，如凝血因子Ⅸ、凝血因子Ⅺ、抗胰蛋白酶、促红细胞生成素（EPO）等。同时转基因兔、羊、猪、牛、鸡和鱼等动物相继问世。动物克隆及干细胞技术与转基因动物技术相结合，大大加快了动物生物反应器的研究与应用进展。

（7）动物细胞的杂交及克隆趋于成熟。

1962年Okata发现仙台病毒可诱发艾氏腹水肿瘤细胞融合，形成多核细胞，为动物细胞融合技术的发展奠定了基础。1964年Littlefield设计出了杂种细胞筛选的系列方法。1975年，Kohler、Milstein和Jerne利用动物细胞杂交技术创立了杂交瘤技术，并借此制备出了纯度高、特异性较强的单克隆抗体，因此于1984年获得诺贝尔生理学或医学奖。1977年英国利用胚胎工程技术成功地培养出世界首例试管婴儿。1997年，Wilmut领导的小组用体细胞核克隆出了绵羊Dolly，使哺乳动物的克隆成了现实。2001年英国培育出首批转基因猪。

（8）胚胎干细胞技术的发展。

1981年，Evans和Kaufman用延迟胚胎着床的方法分离胚胎内细胞团，首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞。1998年Thomason等成功建立了人胚胎干细胞系；1999年又发现成体干细胞的“可塑性”，干细胞研究荣登Science杂志1999年度十大科技成果榜首，2002年干细胞研究又被Science杂志列为值得关注的六大科技领域之一。其后干细胞的研究不断取得新的进展，使人们看到在体外培育目的细胞、组织甚至器官，用于临床修复或取代人体内的病变组织器官的美好前景。

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