（一）破伤风梭菌感染特性
破伤风梭菌（破伤风梭状芽孢杆菌，Clostridium tetani）是一种革兰阳性厌氧菌，芽孢广泛分布于自然界中，一般不引起疾病，通过侵入人体伤口生长繁殖产生的毒素可引起一种急性特异性感染，该感染称为破伤风。破伤风梭菌能产生两种强烈的外毒素，一种是破伤风痉挛毒素，能迅速与神经组织发生不可逆性结合，而引起特征性的全身横纹肌持续性收缩或阵发性痉挛；另一种是破伤风溶血毒素，可引起局部组织坏死和心肌损害。因此，破伤风是一种毒血症。一切开放性损伤，均有发生破伤风的可能。
破伤风潜伏期长短不一，往往与曾是否接受过预防注射、创伤的性质和部位及伤口的处理等因素有关。平均潜伏期为6～10天，亦有短于24 h或长达20～30天，甚至数月，或仅在摘除存留体内多年的异物如子弹头或弹片后才发生破伤风的。新生儿破伤风一般在断脐带后7天左右发病，故俗称七日风。一般来说，潜伏期或前驱症状持续时间越短，症状越严重，死亡率越高。
（二）破伤风疫苗的制备
吸附破伤风疫苗（adsorbed tetanus vaccine）是采用破伤风梭菌，在适宜的培养基中培养后提取破伤风毒素蛋白经甲醛脱毒、精制，加入氢氧化铝佐剂制成，用于预防破伤风。
1.生产用菌种 菌种应采用产毒效价高、免疫原性强的破伤风梭菌。
2.种子批的建立、传代及检定 种子批的建立应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。种子批应保存于2～8℃。主种子批自启开后传代应不超过5代。工作种子批传代应不超过10代。建立的种子批应进行以下检定。
（1）培养特性：本菌为革兰阳性厌氧菌，适宜生长温度为37℃。在庖肉液体培养基中培养，培养液浑浊、产生气体、具腐败性恶臭。在血琼脂平皿培养基中培养，菌落呈弥漫生长。在半固体培养基中穿刺培养，表现鞭毛动力。
（2）染色镜检：初期培养物涂片革兰染色镜检呈阳性，杆形菌体，少见芽孢。48 h以后培养物涂片革兰染色镜检，易转为阴性，可见芽孢，菌体呈鼓槌状，芽孢位于顶端，为正圆形。
（3）生化反应：不发酵糖类，液化明胶，产生硫化氢；不还原硝酸盐。
（4）产毒试验：菌种经液体产毒培养基培养，培养物除菌过滤，取滤液0.1 mL注射于体重为18～22 g的小鼠尾根部皮下，至少4只。于注射后12～24 h观察小鼠，应出现小鼠尾部僵直竖起、后腿强直痉挛或全身肌肉痉挛等症状，甚至死亡的现象。
（5）特异性中和试验：取适量产毒培养滤液与相应稀释的破伤风抗毒素经体外中和后，注射于体重为18～22 g的小鼠腹部皮下，每只小鼠注射0.4 mL，至少4只；同时取未结合破伤风抗毒素的培养滤液0.4 mL，注射于小鼠的腹部皮下，作为阳性对照。注射后每日观察，对照组小鼠应出现明显破伤风症状并死亡，试验组小鼠应存活。
3.类毒素原液的制备
（1）毒素的获得。
生产用种子：工作种子批生产前应检查菌种的全部特性，合格后方可用于生产。中国采用的生产菌种是罗马尼亚L58株，菌号为64008。工作种子批先在产毒培养基种子管中传2～3代，再转至产毒培养基菌种瓶中制成生产用种子。培养基：采用酪蛋白、黄豆蛋白、牛肉等蛋白质经加深水解后的培养基。产毒与收获：毒素制造过程中应严格控制杂菌的污染，经显微镜检查或纯菌试验发现污染者应废弃。检测培养物滤液或离心上清液，毒素经除菌过滤（通过0.22 μm的微孔膜过滤除去菌体）后效价应不低于40 Lf/mL。
（2）脱毒。
毒素或精制毒素的脱毒：毒素或精制毒素中加入适量甲醛溶液，置于适宜温度下进行脱毒。现在采用的方法是0.36%的甲醛，pH中性，37℃脱毒30天。脱毒检查：每瓶取样，取体重为300～400 g的豚鼠至少2只，每只皮下注射500 Lf。精制毒素脱毒检查时可事先用生理盐水稀释成100 Lf/mL，皮下注射5 mL，于注射后第7、14、21天进行观察，动物不应有破伤风症状，到期每只动物体重不得较注射前减轻，且健存者为合格。体重减轻者应重复试验。发生破伤风症状者，原液应继续脱毒。脱毒检查合格的类毒素应做絮状单位（Lf）测定。类毒素应为黄色或棕黄色透明液体。
（3）精制。(www.xing528.com)
毒素或类毒素可用等电点沉淀、超滤、硫酸铵盐析等方法或经批准的其他适宜方法精制。用于精制的类毒素应透明，无肉眼可见染菌。类毒素精制后应加0.1 g/L硫柳汞防腐，并应尽快除菌过滤。用同一菌种、培养基制备的类毒素，在同一容器内混合均匀后除菌过滤者为1批。类毒素原液保存于2～8℃，自精制之日起或先精制后脱毒的制品从脱毒试验合格之日起，有效期为3年6个月。
（4）类毒素原液检定。
①pH与纯度：pH应为6.6～7.4，每1 mg中蛋白氮应不低于1500 Lf。
②特异性毒性检查：每瓶原液等量取样混合，用生理盐水稀释为250 Lf/mL，取体重为250～350 g的豚鼠4只，每只皮下注射2 mL。于注射后第7、14及21天进行观察，局部无化脓、无坏死，动物不应有破伤风症状，到期每只动物体重比注射前增加者为合格。
③毒性逆转试验：每瓶原液取样，用PBS（pH 7.0～7.4）分别稀释至7～10 Lf/mL，37℃下放置42天，取体重为250～350 g的豚鼠4只，每只皮下注射5 mL，于注射后第7、14及21天进行观察，动物不得有破伤风症状，到期每只动物体重比注射前增加为合格。
4.半成品的制备
（1）佐剂配制：可用三氯化铝加氨水法或三氯化铝加氢氧化钠法配制氢氧化铝，用氨水配制需透析除氨后使用。配制成的氢氧化铝原液应为浅蓝色或乳白色的胶体悬液，不应含有凝块或异物。氢氧化铝原液应测定氢氧化铝及氯化钠含量。
（2）吸附类毒素的配制：每1 mL应含类毒素7～10 Lf，氢氧化铝含量应不高于3.0 mg/mL，同时可加0.05～0.10 g/L硫柳汞作防腐剂。
（3）半成品的检定：依法进行无菌检查，应符合规定。
5.成品的制备
（1）所配制的半成品应按照“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定进行相应的分批、分装及冻干后包装。规格为每瓶0.5、1.0、2.0、5.0 mL。每一次人用剂量为0.5 mL，含破伤风类毒素效价不低于40 IU。
（2）成品的检定。
①鉴别试验。可选择下列一种方式进行：疫苗注射动物后应产生破伤风抗体；疫苗加入枸橼酸钠或碳酸钠将吸附剂溶解后做絮状试验，应出现絮状反应；疫苗经解聚液溶解佐剂后取上清液，做凝胶免疫沉淀试验，应出现免疫沉淀反应。
②外观：振摇后应为乳白色均匀悬液，无摇不散的凝块及异物。
③化学检定：pH应为6.0～7.0；氢氧化铝含量应不高于3.0 mg/mL；氯化钠含量应为7.5～9.5 g/L；硫柳汞含量应不高于0.1 g/L；游离甲醛含量应不高于0.2 g/L。
④效价测定：每1次人用剂量（0.5 mL）中破伤风类毒素效价应不低于40 IU。
⑤特异性毒性检查：每亚批等量取样混合，用体重为250～350 g的豚鼠4只，每只注射2.5 mL于腹部皮下，注射后第7、14及21天各观察1次并称体重，动物不应有破伤风症状，注射部位无化脓、无坏死，到期体重较注射前增加者为合格。
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