细菌慢性感染的疫苗研究进展

以结核分枝杆菌疫苗为例进行介绍。

（一）结核分枝杆菌感染特性

结核分枝杆菌属于胞内感染菌，生长缓慢，可通过呼吸道、消化道和破损的皮肤黏膜进入机体，感染过程以慢性为主。结核分枝杆菌感染症状以肺结核为主，也可以侵犯脑膜、腹膜及骨关节等。结核分枝杆菌致病可能是细菌在组织细胞内不断增殖引起炎症反应，以及诱导机体产生迟发型变态反应性免疫病理损伤。

1891年，Robbert Koch在试验动物上观察到结核分枝杆菌感染时细胞免疫与迟发型变态反应同时存在，并与结核病的进程有关，称之为科赫现象。科赫现象表述如下：在初次感染结核分枝杆菌的动物中感染炎症灶-溃疡深，不易愈合，细菌全身扩散；再次用适量结核分枝杆菌感染动物时，溃疡迅速形成，感染炎症灶-溃疡浅，易愈合，细菌不扩散，提示机体已经有一定的抗结核分枝杆菌的免疫力，同时也提示，感染结核分枝杆菌后在产生免疫应答的同时发生迟发型变态反应；用过量的结核分枝杆菌再次感染动物时，会引起剧烈的迟发型变态反应导致病变加重，提示迟发型变态反应对机体不利。试验动物中的科赫现象与人类原发性肺结核病的情况类似。

（二）结核分枝杆菌疫苗（卡介苗）的制备

20世纪初，法国的两位细菌学家——卡默德和介兰历经13年的时间，成功培育了第230代被驯服的结核分枝杆菌，作为人工疫苗，又称卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）。卡介苗是世界卫生组织（WHO）推荐的在全球范围内婴幼儿接种预防结核病的疫苗。皮内注射用的卡介苗（BCG）接种的主要对象是新生儿，接种后可预防儿童发生结核病，特别是可预防结核性脑膜炎的发生。

结核分枝杆菌是细胞内的寄生菌，因此人体抗结核分枝杆菌的特异性免疫主要是细胞免疫。接种卡介苗是用无毒结核分枝杆菌人工接种进行初次感染，经过巨噬细胞的加工处理，将其抗原信息呈递给免疫活性细胞，使T细胞分化增殖，形成致敏淋巴细胞，当机体再遇到结核分枝杆菌感染时，巨噬细胞和致敏淋巴细胞迅速被激活，执行免疫功能，引起特异性免疫反应。

1.研究环境要求　卡介苗生产车间必须与其他生物制品生产车间及实验室分开。所需设备及器具均须单独设置并专用。卡介苗制造、包装及保存过程均须避光。制备人员必须身体健康，经X线检查无结核病，且每年经X线检查1～2次，可疑者应暂离卡介苗的制造车间。(www.xing528.com)

2.制备方法　生产用菌种须符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定，采用结核分枝杆菌D2 PB302菌株。严禁使用通过动物传代的菌种卡介苗。

种子批的建立与鉴定应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。工作种子批到菌体收集中，传代应不超过12代。建立的种子批应进行以下全面检定：①培养特性：使用结核分枝杆菌专用的苏通马铃薯培养基，培养温度在37～39℃之间。抗酸染色应为阳性。在苏通马铃薯培养基上培养的结核分枝杆菌应干皱成团且略呈浅黄色。在苏通马铃薯培养基上结核分枝杆菌应浮于表面，为多皱、微带黄色的菌膜。②毒力试验：用结核菌素纯蛋白衍生物皮肤试验（皮内注射0.2 mL，含10 IU）阴性、体重为300～400 g的同性豚鼠4只，各腹腔注射菌液1 mL（菌液浓度为5 mg/mL），每周称体重，5周内动物体重不应减轻；同时解剖检查，大网膜上可出现脓疱，肠系膜淋巴结及脾可能肿大，肝及其他脏器应无肉眼可见的病变。③无有毒分枝杆菌试验：结果应为合格。用结核菌素纯蛋白衍生物皮肤试验（皮内注射0.2 mL，含10 IU）阴性、体重为300～400 g的同性豚鼠6只，于股内侧皮下各注射1 mL菌液（浓度为10 mg/mL），注射前称体重，注射后每周观察1次注射部位及局部淋巴结的变化，每2周称体重1次，豚鼠体重不应降低。6周时解剖3只豚鼠，满3个月时解剖另3只，检查各脏器应无肉眼可见的结核病变。若有可疑病灶时，应做涂片和组织切片检查，并将部分病灶磨碎，加少量生理盐水混匀后，由皮下注射2只豚鼠，若证实系结核病变，该菌种即应废弃。④免疫力试验：将体重为300～400 g的同性豚鼠8只，分成两组，免疫组经皮下注射种子批菌种制备的疫苗0.2 mL（1/10人用剂量），对照组注射生理盐水0.2 mL。豚鼠免疫后4～5周，用103～104强毒人型结核分枝杆菌皮下冲击免疫，冲击免疫后5～6周解剖动物，免疫组与对照组动物的病变指数及脾脏毒菌分离数的绝对值经统计学处理，应有显著统计学意义。⑤种子批的保存：种子批应冻干保存于8℃以下。原液的制备：a.生产用种子：启开工作种子批菌种，在苏通马铃薯培养基、胆汁马铃薯培养基或液体苏通培养基上每传1次为1代。在马铃薯培养基中培养的菌种置于冰箱中保存，不得超过2个月。b.生产用培养基：苏通马铃薯培养基、胆汁马铃薯培养基或液体苏通培养基。c.接种与培养：挑取生长良好的菌膜，移种于改良苏通培养基或经批准的其他培养基的表面，放置37～39℃静止培养。d.收获和合并：培养结束后，应逐瓶检查，若有污染、湿膜、浑浊等情况应废弃。收集菌膜并压干，移入盛有不锈钢钢珠的瓶内，钢珠与菌体的比例应据研磨机的转速，控制在一定范围，并尽可能在低温下研磨。加入适量无致敏原的稳定剂稀释，制成原液。e.半成品的制备：用稳定剂将原液稀释，即为半成品。f.成品的制备：分装过程应使疫苗混合均匀。疫苗分装后应立即冻干，冻干后应立即封口。

3.检定要求

原液的检定：①纯菌检查：生长物做涂片检查，不得有杂菌。②浓度测定：用国家药品鉴定机构分发的卡介苗参考比浊标准，以分光光度法测定原液浓度，应不超过配制浓度的110%。

半成品的检定：①沉降率测定：将供试品置于2～8℃静置2h，采用分光光度法测定供试品放置前后的吸光度（A580），计算沉降率，结果应不高于20%。②活菌数测定：应不低于1.0×107 CFU/mg。③活力测定：采用XTT法测定，其原理是细菌在代谢过程中，通过氧化-还原反应将XTT还原为可溶性的亮色产物甲臜，甲臜含量反映了细菌的活菌数量。将该方法应用于卡介苗活菌含量的快速检测中，通过已知活菌含量BCG参考品制备活菌含量和XTT有色产物吸光度的参比曲线，根据未知样品的吸光度，在此参比曲线上读出未知样品的活菌含量。将供试品和参考品稀释至0.5 mg/mL，取25μL分别加到培养孔中，于37～39℃避光培养24 h，检测吸光度，供试品吸光度应大于参考品吸光度。④菌体浓度的测定：菌体的浓度与其吸光度大小有一定的关系。原液稀释10倍后，测其吸光度，通过吸光度大小来判断菌体含量的多少。

成品的检定：除了水分测定、活菌数测定和热稳定性试验外，按标示量加入灭菌注射用水，复溶后进行下列各项检定。①鉴别试验：应做抗酸染色涂片检查，细菌形态与特性应符合卡介苗特征。②外观：白色疏松体或粉末状，按指示量加入注射用水，应在3 min内复溶至均匀悬液。③水分：应不高于3.0%。④效力测定：结核菌素纯蛋白衍生物皮肤试验是阴性结果，皮肤试验为皮内注射，用量为0.2 mL，含10 IU，取体重为300～400 g的同性豚鼠4只，分别皮下注射供试品0.5 mg。注射5周后皮内注射卡介苗纯蛋白衍生物TB-PPD（purified protein derivative tuberculin，PPD）10 IU，并于24 h后观察结果，局部硬结反应直径应不小于5 mm。⑤活菌数测定：每亚批疫苗均应做活菌数测定。抽取5支疫苗稀释并混合后进行测定，培养4周后含活菌数应不低于1.0×106 CFU/mg。本试验可与热稳定性试验同时进行。⑥无有毒结核分枝杆菌试验：结核菌素纯蛋白衍生物皮肤试验是阴性结果，皮肤试验为皮内注射，用量为0.2 mL，含10 IU，取体重为300～400 g的同性豚鼠6只，分别皮下注射相当于50次人用剂量的供试品，每2周称量一次，观察6周，动物体重不应该减轻，配合解剖检查，肺、脾、肝等脏器无结核病变，即为合格。⑦热稳定性试验：取每亚批疫苗，于37℃放置28天测定活菌数，并与2～8℃保存的同批疫苗比较，计算活菌率，37℃放置的本品活菌数应不低于置于2～8℃保存的本品的25%，且不低于2.5×105CFU/mg。

保存、运输及有效期：于2～8℃避光保存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。保质期一般是一年。