如何制备反义核酸药物：化学合成与基因工程法

（一）反义核酸药物的制备

反义核酸药物主要通过化学合成法或基因工程法进行制备。化学合成法主要利用亚磷酰胺化学合成法，即基于N-取代的2，4-二羟基丁酰胺的固相载体和亚磷酰胺通用试剂合成寡核苷酸，通过脱二甲氧基三苯甲基、偶联、封闭和氧化/硫化四步进行循环反应，最后从固相载体上切割下来并进行脱保护和纯化处理。目前多采用自动合成仪进行合成。基因工程法制备反义核酸药物类似于一般基因克隆的表达方式，即由cDNA的制备、反义RNA表达载体的构建和表达细胞的转染3个步骤构成，最后在细胞内转录出反义RNA。

反义核酸药物中，以反义寡脱氧核苷酸（antisense oligodetoxynucleotide，ASODN）药物最为常见。ASODN药物的合成主要注意自动合成仪、载体、硫代试剂以及脱保护试剂4个方面的要点。

1.自动合成仪　目前，ASODN药物广泛使用DNA自动合成仪合成。由于使用DNA自动合成仪能进行有效和快速的偶联以及起始原料稳定，自动合成仪合成已成为多数药厂的首选方法。同时核酸化学的快速发展，包括磷酸骨架的修饰、非标准碱基的合成以及在3'或5'端进行非放射性标记等技术，也极大地促进了包括ASODN药物在内的反义核酸药物的发展。

2.载体　目前应用最广泛的载体是控孔玻璃（controlled pore glass，CPG）和聚苯乙烯。CPG由于价廉易得、刚性及粒度较好而受到欢迎。最近，一种具有2-羟甲基-6-硝基苯甲酰（HMNB）保护基团的CPG用于合成3'-氨基烷基化的寡核苷酸，在55℃浓氨水中氨解2h可以从载体上完全切除带有游离3'-氨基基团的寡核苷酸。但CPG很难做到高载量（100μmol/g以上）。而聚苯乙烯则可以制得高载量的载体，为反义核酸药物的大规模制备开辟了道路。新研制的高效反义核酸固相合成载体Primer Support 200，是以30 mm的均一聚苯乙烯为基质的反义核酸合成的载体，也是专门用于研究及生产高纯度药用级反义核酸的载体，它具有高载量（200μmol/g）、高合成效率、低合成失败片段、低试剂消耗和高重复性等优点。

3.硫代试剂　ASODN药物中研究开展较早、了解比较深入的是硫代寡核苷酸。硫代寡核苷酸是核苷磷酸键中一个非桥连的氧原子被硫原子取代所产生的产物。它的合成工艺成熟并已有临床产品上市。高效的硫转移步骤所需的硫代试剂是硫代寡核苷酸合成的关键。目前使用的硫代试剂包括苯甲酰甲基二硫化物、二苯甲酰四硫化物、3H-1，2-苯并二硫醇-3-酮-1，1-二氧化物（Beaucage试剂）、四乙基秋兰姆二硫化物（TETD）、双（O，O-二异丙氨基硫代磷酸）二硫化物（s-Tetral）等，其中后3种试剂较为常用。Beaucage试剂是一种极其快速的硫代试剂，但大规模使用时其合成过程和稳定性均存在问题。TETD比较经济，可以大规模制备且性质相对稳定，但其硫代速率慢、效率较低。s-Tetral是一种相对价廉、易于处理和高效的硫代试剂，但不适于大规模合成。最近有报道，苯乙酰二硫化物（PADS）可作为硫代试剂，其在室温下放置1个月也不影响硫代效果，具有较好的稳定性。

4.脱保护试剂　二氯乙酸/三氯乙酸溶于二氯甲烷常作为标准的脱保护试剂。试验证明，使用二氯乙酸/三氯乙酸溶于甲苯作为脱保护试剂进行合成时，能得到和用二氯甲烷作为溶剂一样的产率和纯度，还避免了高挥发性、高毒性和高致癌性的二氯甲烷的使用。

总之，反义核酸药物（包括ASODN药物），以及其他一些新型RNA药物，如siRNA、miRNA等的合成方法都较为类似，都是亚磷酰胺或者修饰的亚磷酰胺化学合成。优化的高质量试剂、干燥的合成环境是得到高偶联效率和高纯度产品的关键。(www.xing528.com)

（二）siRNA的制备

目前制备siRNA的方法主要有体外制备法和体内转录法。体外制备法包括化学合成法、体外转录法、体外酶切法，同时还需对RNA进行适当的化学修饰以增强其稳定性；体内转录法则是用表达siRNA或miRNA的质粒或病毒，或者PCR产物转染细胞，在细胞内产生所需的siRNA。

1.化学合成法　以核苷酸单体为原料，通过化学合成的方法合成正义链和反义链，然后退火形成双链siRNA。这是siRNA合成的经典方法，合成成本高但获得的序列最为准确。

2.体外转录法　在体外通过T7 RNA聚合酶进行体外转录获得正义链和反义链，经过退火纯化后得到双链siRNA。此方法应用简便，相对化学合成法价格低廉，现已广泛用于RNAi试验，适合siRNA设计序列的筛选。

3.体外酶切法　按照体外转录法合成200～1000 bp长度的dsDNA，然后在大肠杆菌核酸酶Ⅲ（RNase Ⅲ）的作用下进行切割，纯化后获得混合的siRNA群，可有效抑制靶基因。此方法无须设计和筛选有效的siRNA序列，适用于大规模RNAi试验。

4.体内转录法　通过携带RNA聚合酶Ⅲ启动子U6或H1及其下游设计的靶siRNA序列特殊结构的质粒或病毒载体或PCR片段，转染细胞后可转录出短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA），shRNA在Dicer酶的作用下被剪切成siRNA从而发挥作用。利用稳定表达系统可实现长时间的基因沉默作用。