双特异性抗体：构建和应用

（一）双特异性抗体的基本概念

双特异性抗体（bispecific antibody，BsAb），也称为双功能抗体（bifunctional antibody，BfAb），是含两种（或多种）针对不同抗原的特异性抗原结合位点的人工抗体。由于可以同时和两种（或多种）抗原发生反应，并使之交联，能在靶细胞和功能分子（或效应细胞）之间架起桥梁，因此，双特异性抗体能够起到特殊的生物学功能。具体生物学功能：①免疫细胞的招募和激活，通过同时靶向肿瘤和免疫细胞达到召集免疫细胞和清除肿瘤细胞的目的；②受体共刺激或抑制，利用BsAb拮抗两种或两种以上信号转导配体，避免逃逸机制从而改善治疗效果，如CTLA4-PD-1、VEGF-PDGF等；③促进蛋白复合物形成，如用于治疗A型血友病的艾美赛珠单抗（Emicizumab），同时结合凝血级联酶促反应中的凝血因子Ⅸa和因子Ⅹ，桥连因子Ⅸa与因子Ⅹ，促进因子Ⅹa的产生，部分模拟了因子Ⅷ的功能，但因其与因子Ⅷ没有序列同源性，因此并不会诱导或增强因子Ⅷ抑制物的产生；④多价病毒中和等。

（二）双特异性抗体的构建

由于双特异性抗体构建方式灵活，目前已有报道的双特异性抗体形式至少有45种。按照其结构特征主要分为含Fc区的双特异性抗体（IgG型双特异性抗体）和不含Fc区的双特异性抗体（非IgG型双特异性抗体）两大类。含Fc区的双特异性抗体保持了传统的单克隆抗体的结构，具有两个Fab区和一个Fc区，这两个Fab区可以结合不同抗原，此类抗体主要有Triomab/quadroma、DVD-Ig（dual variable domain Ig）、CrossMAb、Two-in-one（2in1）IgG、scFv2-Fc、KiH-IgG等（图3-10）。不含Fc区的双特异性抗体缺失Fc区，由两个抗体的VH区及VL区组成或者由Fab片段组成。由于缺少Fc段，仅通过抗原结合力发挥治疗作用，具有较低的免疫原性，易于生产，相对分子质量小。因相对分子质量较小，其在肿瘤组织的渗透性较高，因此具有更强的治疗效果。此类双特异性抗体有诸多形式，主要包括BiTE（bi-specific Tcell engager）、DART（dual affinity retargeting）、TandAbs（tandem diabody）、scFv-HSAscFv、双纳米抗体（bi-nanobody）等。

图3-10　双特异性抗体的结构示意图(www.xing528.com)

（三）双特异性抗体的制备

双特异性抗体可以用化学偶联法、双杂交瘤细胞融合法和基因工程技术等方法获得。化学偶联法和双杂交瘤细胞融合法生产的BsAb为鼠源性，具有较强的免疫原性，且产量低、纯度差，在临床应用上受到很大的制约，基因工程是目前制备BsAb使用最多的技术。

1.化学偶联法　该方法最早出现于20世纪80年代，其原理是通过化学偶联剂将两个完整IgG或两个F（ab）2抗体片段偶联成一种BsAb，这种方法快速、简便，但是容易破坏抗原结合部位从而影响抗体活性，同时交联剂本身的安全性和致癌性不确定。

2.双杂交瘤细胞融合法　通过细胞融合的方法将两株不同的杂交瘤细胞融合成双杂交瘤细胞株，然后通过常规的杂交瘤筛选法克隆靶细胞。由于双杂交瘤细胞的遗传物质来源于亲代的两种杂交瘤细胞，必然产生两种重链和两种轻链分子，而这些轻链和重链的随机组合方式至少有十种。由于同质化重链的优先结合以及重链和轻链的无效结合，理论上只有轻链和重链同源配对、重链和重链异源配对的组合才能产生所需的BsAb。双杂交瘤细胞融合法制备BsAb的随机性较大，效率低，但是BsAb生物活性较好，抗体结构比较稳定。

3.基因工程技术　利用基因工程技术制备BsAb是目前最常用的方法。双特异性IgG抗体制备中的主要挑战就是轻链和重链的正确连接。Knobs-into-holes（KiH）方法和CrossMab技术已经可以有效解决重链异源二聚化和同源重链、轻链配对的难题。在KiH方法中，一个抗体的重链CH3区366位体积较小的苏氨酸突变为体积较大的酪氨酸，形成突出的Knob（杵）结构；将另一个抗体重链CH 3区407位酪氨酸残基突变成苏氨酸，形成凹陷的hole（臼）结构；利用杵臼结构的空间位阻效应实现两种不同抗体重链间的正确配对。在CrossMab技术中，一个BsAb的Fab臂通过交换重链和轻链的区域而被修饰，另一条臂保持不变；修饰后的轻链具有部分同源重链，不会再与非同源重链结合，因此保证配对的正确性。

卡妥索单抗（Catumaxomab）是全球首个获批的双特异性抗体药物，由一个靶向肿瘤EpCAM的小鼠IgG2a和一个靶向肿瘤CD3e的大鼠IgG2b构成，是一个三功能抗体，用于恶性腹水的治疗，但于2017年撤市，主要是由于三功能抗体复杂的生产工艺以及异源抗体比较容易产生的免疫原性问题。博纳吐单抗（Blinatumomab）于2014年被美国FDA批准上市，是一种BiTE（双特异性T细胞衔接系统）抗体药物，用于急性淋巴细胞白血病的治疗。