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如何制备单克隆抗体:动物免疫与细胞融合的过程

时间:2023-06-22 理论教育 版权反馈
【摘要】:获得安全的抗原之后,要选择适当的动物进行免疫,以便在动物体内获得针对特异性抗原的单克隆抗体。与制备抗血清有一定差异,制备单克隆抗体时动物免疫的目的是产生足够多的抗原反应性B细胞以满足细胞融合试验的需要。

如何制备单克隆抗体:动物免疫与细胞融合的过程

单克隆抗体制备的大致过程包括抗原制备、动物免疫、B细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞、选择性培养杂交瘤细胞、杂交瘤细胞的选择、杂交瘤细胞克隆化和保存、杂交瘤细胞抗体性状的鉴定、单克隆抗体的大量制备、单克隆抗体的纯化。

(一)抗原制备

要制备特定抗原的单克隆抗体,首先要制备用于免疫的适当抗原(如全细胞、细胞提取物、纯化蛋白、融合蛋白、多肽、糖类、脂类或DNA等),再用抗原进行动物免疫。

(1)提取纯化天然抗原:运用生物大分子分离纯化技术直接从生物标本中分离纯化蛋白分子用作抗原,即天然抗原,包括天然的蛋白质抗原和颗粒性的全细胞抗原(如肿瘤细胞、细菌等)。天然抗原结构比较复杂(除了线性表位外还有构象表位),因此是很好的抗原。制备单克隆抗体时不需要高纯度或单一特异性的抗原,因为在单克隆抗体筛选的过程中每个克隆的特异性都会体现,但高纯度的抗原能提高抗体获得的可能性。全细胞或细胞裂解物(每次注射107个细胞)可以作为细胞内或细胞外抗原分子的天然形式;但特定抗原含量的多少会影响免疫的效果。对于一些含量甚微的低丰度蛋白质抗原,其所需的生物样品量和分离纯化成本极高。生物标本特别是人体标本的获得越来越困难,且由于分离成本极高,得率极低,远远满足不了抗体制备对抗原的需要。因此,除了机体细胞内表达量比较高的蛋白外,从天然生物材料提取纯化蛋白分子作为抗体制备的方法,目前使用很少。

(2)用基因工程技术制备重组蛋白抗原:由于天然蛋白通常含量低,天然生物材料来源不足,因此为获得足够数量的蛋白质抗原,可采用基因工程的方法制备重组蛋白抗原。但是通过原核表达系统获得的重组蛋白,只能实现抗原线性表位及部分构象表位的抗原制备,仅能满足部分抗原的需要。而真核及哺乳动物细胞重组表达系统虽然可以解决抗原构象表位的问题,但表达量偏低,成本过高,因此未能广泛使用。近年来,以质粒为基础的技术在体内诱导表达有免疫原性的蛋白质的新方法已经产生。依靠哺乳动物表达载体上的独特编码序列,携带外源DNA序列的质粒被宿主细胞摄取,在体内产生足量的目标蛋白,从而诱导机体产生强有力的体液免疫应答。当抗原难以制备或基因产物不明确时,可以运用基因免疫接种。这种技术若用在转基因小鼠体内,也可产生针对靶抗原的特异性抗体。

(3)合成多肽半抗原:随着人类、重要动植物以及模式生物等部分生物基因组序列的解码和蛋白组学的迅猛发展,许多潜在抗原的核苷酸序列和氨基酸序列已经得到。根据抗原蛋白的氨基酸序列,借助抗原表位预测分析软件,也能比较准确地预测和筛选出抗原性和免疫原性较好的多肽片段,经人工固相合成,获得抗原表位的多肽片段,即多肽半抗原(polypeptide hapten)。多肽半抗原通常具有单一抗原表位,免疫接种产生的抗体能鉴别线性表位,也能区别靶标是否被修饰,如区分特定多肽上的磷酸化或去磷酸化,但通常不能识别构象表位。因此在选择免疫原制备抗体时应该考虑到所制备抗体的最终用途,并应该根据其用途决定用何种方法筛选抗体更合适。多通道多肽自动合成等技术的应用使得多肽合成效率高、成本低,合成多肽半抗原已成为抗体制备中抗原的主要来源。

(4)小分子半抗原:大多数药物、毒素、环境污染物(相对分子质量小于1000),属于仅有抗原性而无免疫原性的半抗原。如上述多肽、大多数的多糖、甾体激素、脂肪胺、类脂、核苷、某些小分子药物等。这些小分子本身没有免疫原性,当与载体结合形成大分子时,可以获得免疫原性。

(5)半抗原与载体偶联:多肽(10个氨基酸残基左右)等半抗原通常需要通过运用肽链修饰或生物标记技术与载体偶联以提高其免疫原性。典型的载体蛋白包括匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)和卵白蛋白。由于这些载体蛋白具有很高的免疫原性,所以多肽应该与不止一种载体蛋白偶联,以便筛选出的单克隆抗体只识别多肽而不识别载体蛋白。常用的交联方法有碳二亚胺法、戊二醛法、活性酯法、混合酸酐法、重氮化法、同型或异型双功能交联剂法等数十种,交联剂已达数百种之多。

在免疫接种前有必要先检查所制备的抗原中是否含有潜在病原体。这尤其适用于细胞抗原、细胞系产生的蛋白质或者在有血清存在的情况下制备的蛋白质。筛选试验,称为小鼠抗体生产筛查(mouse antibody production screening,MAPS)试验,包括用每种特定抗原(2×107个细胞或10~100 μg蛋白质)接种经检疫的无特定病原体(specific pathogen free,SPF)动物,观察4周后,收集免疫后动物的血清,和免疫前的血清比较对一系列已知病原体的反应。阳性结果意味着抗原已被污染,应当舍弃;阴性结果表明抗原是安全的,可用于体内注射。获得安全的抗原之后,要选择适当的动物进行免疫,以便在动物体内获得针对特异性抗原的单克隆抗体。

(二)动物免疫

(1)免疫动物的选择:制备单克隆抗体时应根据所使用的骨髓瘤细胞的来源及动物品系选用免疫动物。免疫动物和骨髓瘤细胞在种系上距离越远,产生的杂交瘤细胞就会越不稳定,所以一般采用与骨髓瘤细胞供体同一品系的动物进行免疫。常用的骨髓瘤细胞来自BALB/c小鼠和Lou/c大鼠,免疫动物也采用相应的品系。如BALB/c小鼠的淋巴细胞与同品种小鼠的骨髓瘤细胞融合,所得杂交瘤细胞的染色体稳定,也能较理想地分泌目的抗体;而人鼠或兔鼠所得的杂交瘤细胞染色体很不稳定,分泌单克隆抗体的能力也会很快丧失;另一方面,所选的动物品系对抗原免疫应答要强。

(2)免疫方法:设计免疫程序时,应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与免疫间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的免疫应答能力等。没有一个免疫程序能适用于各种抗原。

制备抗血清时免疫接种的目的是血清中含有很高的抗体效价,需要免疫细胞产生很强的防御活性。与制备抗血清有一定差异,制备单克隆抗体时动物免疫的目的是产生足够多的抗原反应性B细胞以满足细胞融合试验的需要。

免疫方法包括体内、体外和脾内免疫法。体内免疫法通常适用于免疫原性强、抗原量较多的情况。体外免疫法则用于不能采用体内免疫法的情况,如制备人单克隆抗体,或者抗原的免疫原性极弱且能引起免疫抑制。体外免疫法所需抗原量少、免疫时间较短(仅4~5天)、干扰因素少,主要分泌IgM,但融合后产生的杂交瘤细胞不够稳定。目前通常采用的是脾内免疫法,即在麻醉条件下将抗原直接注入脾脏,为了提高免疫效果有时需加入佐剂。但是融合前最后一次加强免疫,通常采用腹腔或静脉注射、不含佐剂。脾内免疫法可提高小鼠对抗原的免疫反应性,且节省时间,一般免疫3天后即可取脾脏进行融合过程。免疫时应用的抗原剂量需根据其免疫原性和纯度而定。一般对于可溶性蛋白质抗原,采用1次免疫,每只小鼠用量为5~100μg;对于细胞或颗粒性抗原,如肿瘤细胞,通常每只小鼠用量为1×106~1×107个细胞比较合适。

为达到最高融合率,需要获得尽可能多的浆母细胞,在最后一次加强免疫后第3~4天取脾脏进行融合过程较为适宜。在初次免疫应答时取脾细胞与骨髓瘤细胞融合,获得的杂交瘤细胞主要分泌IgM,再次免疫应答时获得的杂交瘤细胞主要分泌IgG。

(三)细胞融合

细胞融合(cell fusion)是两个或两个以上的细胞融合成一个细胞的过程。在单克隆抗体制备过程中是将免疫动物的分泌抗体的脾细胞与不分泌抗体的骨髓瘤细胞融合,使之生成一类既能不断分泌特异性抗体又能在体内外不断分裂增殖的杂交瘤细胞。

(1)骨髓瘤细胞:用于融合的骨髓瘤细胞应具备融合率高、自身不分泌抗体、所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点,同时应带有便于选择的遗传标记,如HGPRT基因缺陷等。骨髓瘤细胞的生长状况也是决定细胞融合的关键。如选择处于对数生长期的细胞,其特点是细胞形态良好、活细胞计数高于95%,并且制成数量合适的细胞悬液。一般在准备融合前两周就应开始复苏骨髓瘤细胞。一般的培养液,如RPMI 1640、DMEM培养基,均适合骨髓瘤细胞的生长。小牛血清的浓度一般在10%~20%,细胞的最大密度不得超过10个/毫升,一般扩大培养以1∶10稀释传代,3~5天传代一次。为确保该细胞对HAT选择培养基的敏感性,每3~6个月应用8-氮杂鸟嘌呤(8-AG)筛选一次,以防止细胞发生回复突变。

(2)免疫脾细胞:免疫脾细胞是指处于免疫状态脾脏中的B淋巴母细胞,一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏,制备成细胞悬液。由于此时B淋巴母细胞较大,融合的成功率较高。

(3)饲养细胞:在细胞培养过程中,单个或少数分散的细胞不易生长繁殖,若加入其他活细胞则可以促进这些细胞生长繁殖,所加入的细胞称饲养细胞(feeder cell)。在制备单克隆抗体的过程中,多个环节需要加入饲养细胞。饲养细胞除能满足杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性外,还能释放某些生长因子。常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞,也有用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞。因小鼠腹腔巨噬细胞还能清除死细胞,故常用。通常在细胞融合前2~3天制备小鼠腹腔巨噬细胞。

(4)免疫脾细胞与骨髓瘤细胞的融合:细胞融合的操作方法常用的有转动法和离心法。融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为(1∶1)~(10∶1),(3∶1)~(5∶1)更为常用。目前常用聚乙二醇(PEG)作为细胞融合剂。一般来说,PEG的相对分子质量和浓度越大,其促融合的效率越高,但其黏度和细胞毒性也越大。常用PEG相对分子质量为4000,浓度为40%~50%。还可在PEG溶液中加入DMSO,以提高细胞接触的紧密性,提高融合率。但必须严格控制接触时间,因为PEG和DMSO都对细胞有毒性。提高融合率的另外几种方法包括用秋水仙素预处理骨髓瘤细胞使其细胞周期发生一定变化,采用电融合技术,加入饲养细胞促进杂交瘤细胞生长。融合操作的大致流程:取适量脾细胞与骨髓瘤细胞混合,在PEG作用下温育,诱导细胞融合,时间控制在2 min内,然后用培养液将融合操作的混合液缓慢稀释以终止融合剂的作用。

(四)杂交瘤细胞的选择

经细胞融合操作后,混合物中存在未融合的单核亲本细胞(脾细胞、瘤细胞)、同型融合多核细胞(如脾-脾、瘤-瘤的融合细胞)、异型融合的双核细胞(脾-瘤融合细胞)和多核杂交瘤细胞等多种细胞,如何从中筛选出异型融合的双核杂交瘤细胞是杂交瘤技术的目的与关键之一。

通常使用HAT选择培养基对杂交瘤细胞进行筛选。用HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞是基于上述细胞的代谢特点。在哺乳动物细胞中,核酸的基本单位核苷酸有两种不同的合成途径:一条途径为从头合成途径,由氨基酸和一些小分子化合物合成,是主要途径,其中叶酸的还原产物——四氢叶酸作为一碳基团的载体是这条途径所必需的;另一条途径是补救合成途径,细胞直接利用已有的碱基或核苷,如次黄嘌呤(hypoxanthine,H)或胸腺嘧啶(thymidine,T)核苷,在相应磷酸核糖转移酶或核苷激酶的催化作用下合成核苷酸,这个途径中的两种重要酶分别是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase,HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(thymidine kinase,TK)。在从头合成途径被叶酸的拮抗物——氨基蝶呤(aminopterin)所阻断时,对于正常细胞或其他肿瘤细胞,如果培养基中含次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷,则可通过补救合成途径合成核苷酸进而合成核酸。但杂交瘤试验中所用的骨髓瘤细胞株缺乏HGPRT或TK基因,因而两种途径都不能利用,即无法合成核酸满足生长需要,所以不能在加有次黄嘌呤、氨基蝶呤及胸腺嘧啶核苷的选择性培养液中生长。(www.xing528.com)

对于融合混合液中存在的几类细胞来说,正常的淋巴细胞(脾细胞)在体外培养时不能长期存活(通常2周左右),也不能增殖,也不会影响杂交瘤细胞的生长,因此不需要特别处理;未发生融合的骨髓瘤细胞在HAT选择培养基中由于上述原因而死亡。只有骨髓瘤细胞和脾细胞融合所产生的杂交瘤细胞既具有骨髓瘤细胞能在体外无限生长的特性,又从脾细胞中获得了HGPRT和TK基因,因此能在HAT选择培养基中存活和增殖。

经HAT选择培养基培养7~10天,杂交瘤细胞逐渐形成集落,停用HAT选择培养基后换成添加含HT的培养基培养2~4周。当细胞集落面积超过培养孔的1/10时,即可用敏感的免疫学方法检测出阳性孔(有特异性抗体合成的细胞孔)。

经过上述免疫学方法筛选出的阳性孔内,仅有部分杂交瘤细胞是分泌预定特异性抗体的细胞。由于分泌抗体的杂交瘤细胞比不分泌抗体的杂交瘤细胞生长慢,长期混合培养的结果是分泌抗体的细胞被不分泌抗体的细胞淘汰。因此,应该尽快筛选阳性克隆。

筛选(screening)阳性克隆即筛选能分泌预定特异性抗体的杂交瘤细胞。具体方法是用免疫动物时使用的抗原分别检测上述所有杂交瘤细胞孔中分泌的抗体。筛选方法应微量、快速、特异、敏感、简便并能一次检测大批样本。常用的方法有ELISA,用于可溶性蛋白质抗原、细胞和病毒等制备的抗体的检测;放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA),用于可溶性抗原、细胞抗体的检测;荧光激活细胞分选仪(fluorescence-activated-cell sorting,FACS),用于针对细胞表面抗原的抗体检测;间接免疫荧光分析(indirect immunofluorescence assay,IFA),用于细胞和病毒抗体的检测。

(五)杂交瘤细胞克隆化和保存

经过上述特异性抗体检测筛选到的杂交瘤细胞孔分泌特异性抗体,但是不能保证一个孔内只有一个细胞克隆。在实际工作中,可能会有数个甚至更多的克隆,可能包括分泌抗体的细胞和不分泌抗体的细胞、所需要的抗体(预定特异性抗体)分泌细胞和其他无关抗体分泌细胞。杂交瘤细胞克隆化(cloning)就是将阳性孔中分泌预定特异性抗体的单个细胞分离出来。由于不分泌抗体的克隆比分泌抗体的克隆生长速度快,因此应尽早检测和克隆化,以避免发生竞争性生长抑制。即使是已经克隆化得到的杂交瘤细胞,也需要定期再克隆,以淘汰突变或染色体丢失的杂交瘤细胞。

常用的克隆培养方法包括有限稀释法和软琼脂法。无论选择哪种方法,杂交瘤细胞都要至少经历两轮亚克隆,一般要经过三次以上才能达到100%的阳性克隆。原始孔的杂交瘤细胞以及每次克隆化得到的亚克隆细胞都应该扩增后及时冻存。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候,在细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等问题。如果没有原始细胞的冻存,则将因为上述意外而前功尽弃。杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系一样。冻存前细胞应处于对数生长期,每次克隆冻存10管,每管5×106个/毫升。冻存细胞要定期复苏,检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性,在液氮中细胞可保存数年或更长时间。

(六)杂交瘤细胞抗体性状的鉴定

(1)杂交瘤细胞的鉴定。

①抗体分泌稳定性:鉴定杂交瘤细胞质量的一个重要指标是其分泌抗体能力的稳定性,可用连续传代法进行检测。

②染色体分析:正常小鼠脾细胞的染色体数是40,全部为端着丝粒染色体;小鼠骨髓瘤细胞染色体数目变异较大,如SP2/0细胞为62~68,NS-1为54~64,大多数为非整倍性,有中部和亚中部着丝点。杂交瘤细胞的染色体数目接近两亲本细胞染色体数目的总和,在结构上多数为端着丝粒染色体外,还应出现少数标志染色体。染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞一般能分泌高效价的抗体。

③鼠源病毒检查:由于骨髓瘤细胞为肿瘤细胞,往往有潜在病毒污染,如流行性出血热病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒等,因而需要进行病毒污染检测。具体操作可按《中国药典》(2015年版)鼠源病毒检查法进行。

支原体检查:可按《中国药典》(2015年版)生物制品无菌试验规程进行。支原体污染实验室检测方法有形态学检查、支原体培养、抗原检测、血清学方法和分子生物学方法。结果应为阴性。

⑤无菌试验:杂交瘤细胞无菌试验按《中国药典》(2015年版)生物制品无菌试验规程进行,可同时进行上清液和细胞悬液的检查。

(2)单克隆抗体的鉴定:在建立稳定分泌单克隆抗体杂交瘤细胞株的基础上,应对制备的单克隆抗体的特性进行系统的鉴定。一般进行以下几个方面的鉴定:①抗体的特异性和交叉反应情况;②抗体的类型;③抗体的中和活性;④抗体识别的抗原表位;⑤抗体的亲和力。

(七)单克隆抗体的大量制备

目前大量制备单克隆抗体的方法主要有体外培养和体内培养两种方法。

(1)体外培养:体外培养使用旋转培养容器大量培养杂交瘤细胞,从细胞培养上清液中获取单克隆抗体。一般包括悬浮培养法和固相培养法,后者又有微载体培养法、多孔载体培养法、微囊化培养法和中空纤维培养法等。体外培养生产工艺简单、易控制,可以大规模生产,治疗用途的单克隆抗体多采用此法生产,但此方法产量较低,一般悬浮培养法上清液含量为10~60 mg/L,采用微囊技术生产的抗体可达0.1~1 g/L。

(2)体内培养:体内培养利用活体动物作为生物反应器,将杂交瘤细胞注射到动物体内生长并分泌单克隆抗体。常规操作是先给BALB/c小鼠腹腔注射降植烷酸或液体石蜡0.5 mL,1~2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞,接种细胞7~10天后可产生腹水,密切观察动物的健康状况与腹水征象,可间隔、多次抽取腹水,也可待腹水尽可能多而濒于死亡之前处死小鼠,抽取全部腹水。一般一只小鼠可获得1~10 mL腹水,1000g离心5 min后,取上清液保存。沉淀中的细胞可再给另外小鼠注射,其形成腹水的速度比原杂交瘤细胞快。还可将腹水中的细胞冻存起来,复苏后转种小鼠腹腔。常用的腹水制备法制备的腹水中单克隆抗体浓度可达5~20 g/L,是一般用途的单克隆抗体制备的首选方法。缺点是动物腹水中混有来自动物的多种蛋白,给纯化带来困难,同时要消耗大量活体动物。

(八)单克隆抗体的纯化

确定单克隆抗体的类型后,根据抗体的用途综合选定纯化方法。对于体外诊断用的单克隆抗体,IgG采用沉淀法结合亲和层析法,IgM采用沉淀法结合凝胶过滤法。对于体内诊断或治疗用的单克隆抗体,应去除内毒素、核酸、病毒等可能的微量污染,必须经亲和层析法和阴离子交换层析法纯化。

腹水中单抗的纯化:①澄清和沉淀处理:先1000g离心5 min以去除沉淀,然后20000g高速离心30 min以去除残留的小颗粒物质,再用0.2μm的微孔滤膜过滤,除去污染的细菌、支原体和类脂,然后用饱和硫酸铵沉淀抗体。②分离纯化:采用凝胶过滤法、阴离子交换层析法和亲和层析法等。

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