全人源单克隆抗体技术的应用与特点

抗体是机体体液免疫关键效应分子，同时还能辅助细胞免疫和补体系统。其Fab片段可特异性结合抗原或靶细胞，Fc片段可介导多种细胞效应功能如ADCC等，此外Fc段与FcRn类似受体结合使得抗体在体内的半衰期达10～20天。抗体分子的这些结构与生物学功能保证了其作为治疗性蛋白的药用疗效。

（一）抗体药物的发展历程

抗体在临床上的治疗性应用，可以追溯到1888年Emile Roux应用抗血清治愈白喉患者。而1897年Paul Ehrlich提出的“魔术子弹（magic bullet）”假说则是利用抗体进行靶向治疗的概念的雏形。利用抗原免疫动物可以快速获得含有多克隆抗体的抗血清。但是由于多克隆抗体本质上是针对抗原不同表位的抗体的混合物，其质量并不均一，加之受免疫动物的制备路线所限，多克隆抗体在临床上的应用并不多见。

20世纪70年代，杂交瘤技术的问世使大量制备均一的鼠源单克隆抗体成为可能，为抗体的临床应用带来突破。1982年，Philip Karr将第一株抗独特型单克隆抗体应用于B细胞淋巴瘤的临床治疗并取得成功。1986年，采用杂交瘤技术生产的抗移植后免疫排斥反应的鼠源单克隆抗体莫罗莫那-CD3（Orthoclone OKT3）成为首个经美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准上市的治疗性单克隆抗体。但由于鼠源单克隆抗体严重的免疫原性，即产生人抗鼠抗体（human anti-mouse antibody，HAMA）问题，随后十年抗体药物在临床应用并不广泛。美国FDA批准的另外两个鼠源单克隆抗体分别是替伊莫单抗（Ibritumomab tiuxetan）和131I-托西莫单抗（131I-tositumomab），均为放射性标记抗CD20单抗，但目前仅替伊莫单抗仍用于非霍奇金淋巴瘤的临床治疗，它是放射性核素铟111（In-111）或钇90（Y-90）标记的抗CD20单抗，其余两个鼠源单克隆抗体已撤市。

20世纪80年代，DNA重组技术的发展使得人们有可能进行各种抗体“人源化”改造，单克隆抗体药物因此经历了人鼠嵌合抗体、人源化抗体阶段。如采用人抗体的部分氨基酸序列代替某些鼠源抗体的序列，产生的嵌合抗体可以有效地减少鼠源抗体的免疫原；利用CDR移植技术或表面重塑技术进一步将可变区的FR序列更换为人源序列，得到的人源化抗体（humanized antibody）免疫原性进一步降低。20世纪90年代末上市的诸多嵌合抗体和人源化抗体在临床上得到了广泛应用。如1997年被批准上市的利妥昔单抗（Rituximab）是一种抗CD20的人鼠嵌合型单克隆抗体，含人IgG1恒定区，通过补体依赖的细胞毒作用（complement dependent cytotoxicity，CDC）和ADCC引发B细胞溶解的免疫反应，用于治疗B细胞淋巴瘤和多种自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎、血管炎）。曲妥珠单抗（Trastuzumab）是第一个用于临床的人源化单克隆抗体，属IgG1型，含人的FR区及能与人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）结合的鼠抗p185HER2抗体的决定簇互补区，用于HER2过度表达的转移性乳腺癌的靶向治疗。

嵌合型抗体的人源化程度可达60%～70%，人源化抗体可达90%～95%，但仍不是真正意义上的“人源抗体”，仍然可能引发HAMA反应。随着全人源单克隆抗体技术方面的进步，全人源抗体逐步占据了治疗性抗体药物的研发主流。全人源抗体技术主要包括人-人杂交瘤细胞技术、EB病毒转化的人B细胞技术、高通量抗体库技术和转基因小鼠技术，目前最常用的是转基因小鼠技术结合抗体库技术。

20世纪80年代发展起来的分子展示技术（噬菌体、细菌、酵母、核糖体展示技术等）通过构建大容量人源抗体库，再经高通量体外筛选，为人源化抗体和全人源抗体的制备开辟了新途径。2002年美国FDA批准的阿达木单抗（Adalimumab）是用噬菌体展示技术研制的第一个全人源抗体药物，它是抗肿瘤坏死因子（TNF-α）的IgG1型单克隆抗体，用于类风湿性关节炎、克罗恩病、强直性脊柱炎、斑块状银屑病的治疗。

另一个制备全人源抗体的有效方法是利用转基因小鼠，该鼠用人Ig基因替代鼠的同类基因，经抗原免疫后产生全人源抗体。第一个基于转基因小鼠平台开发的全人源单克隆抗体是2006年美国FDA批准的帕尼单抗（Panitumumab），它是人表皮生长因子受体（EGFR）的IgG2型单克隆抗体，用于治疗EGFR阳性的转移性结肠癌。

基因工程技术应用于抗体改造，除了能降低免疫原性外，还能实现抗体药物小型化、高效化，通过大量表达，降低生产成本，并可能根据需要制备新型抗体。

抗体分子可变区组成的Fv段是与抗原结合的结构基础，在Fv段的基础上可以构建具有抗原结合功能的抗体分子片段，也称作小分子抗体。小分子抗体可作为载体与药物、放射性核素、毒素等结合，也是制备其他更有使用价值的基因工程抗体的基础，如构建抗体融合蛋白、双特异性抗体等。常见的小分子抗体有Fab片段、F（ab'）2抗体片段、单链抗体（single chain Fv，scFv）、单域抗体（single domain antibody，sdAb）等。

抗体融合蛋白是指利用基因工程技术将抗体片段与其他生物活性蛋白融合所得的产物，该重组产物兼具抗体特性和与之融合的蛋白的生物活性。双特异性抗体（bispecific antibody，BsAb）是指具有两个不同抗原结合位点的抗体，如由两个单链抗体通过一个连接肽而成的双特异性T细胞衔接器。目前用于治疗肿瘤的双特异性抗体主要靶向肿瘤相关抗原（TAA）和效应细胞表面抗原，如抗TAA及抗CD3双特异性抗体。BsAb可以用化学交联、细胞融合和基因工程等方法获得，还有一些新制备技术，如CrossMAb技术。

（二）抗体药物的特点、作用机制和分类

抗体药物广义上是指一种以细胞工程、基因工程技术为主体的现代生物技术制备的，与靶抗原的结合具有高特异性、有效性和安全性，临床上用于恶性肿瘤、自身免疫性疾病等重大疾病的生物制剂药物。

（1）抗体药物的特点：抗体药物具有特异性、多样性和可定向制备等特点。特异性主要体现在能特异性结合相关抗原、选择性杀伤靶细胞、在动物体内靶向分布、对特定疾病疗效更佳、临床疗效确切等，多样性是指靶抗原多样性、抗体结构及活性多样性、免疫偶联物与融合蛋白多样性；也可根据需要制备具有不同治疗作用的抗体。

（2）抗体药物的作用机制(www.xing528.com)

①靶点封闭作用：抗体作为拮抗剂，封闭靶抗原表位，阻断其效应。如贝伐珠单抗Avastin（Bevacizumab，靶点VEGF）。

②阻断信号转导：抗体特异性结合靶抗原，阻断其下游信号通路，终止其生物学效应。如曲妥珠单抗Herceptin（Trastuzumab，靶点HER2）。

③靶向载体作用：抗体作为靶向载体交联细胞毒性物质，组成抗体-药物偶联物（antibodydrug conjugate，ADC），发挥靶向杀伤作用。如T-DM1（Ado-trastuzumab emtansine）和利卡汀（131I-metuximab）。

④免疫应答作用：通过抗体结合抗原后的ADCC和CDC而杀伤靶细胞。如利妥昔单抗（Rituximab）。

⑤抗体中和作用：抗体与靶抗原（配体）结合，中和其效应分子。如针对炭疽杆菌的抗体药物Raxibacumab，通过中和炭疽杆菌毒素而发挥作用。

⑥免疫调节作用：特异性抗体与人T细胞抗原结合，阻断T细胞增殖及其功能。如抗CD3抗体药物莫罗莫那-CD3（Muromonab-CD3）。

根据上述作用机制，可针对性地改造治疗性抗体，提高其效应功能。

（3）抗体药物的分类：按抗体分子的组成，可将治疗性抗体药物分为三类。①抗体或抗体片段：完整的抗体包括嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体，抗体片段包括Fab、scFv、BsAb等。②抗体-偶联药物或称免疫偶联物：由抗体或抗体片段与放射性核素、药物或毒素等“弹头”物质连接而成，分别构成放射免疫偶联物、化学免疫偶联物及免疫毒素。③抗体融合蛋白：由抗体片段和活性蛋白融合重组构成。

（三）抗体药物的发展趋势

随着分子生物学以及生物信息学等相关学科的飞速发展，基因工程抗体技术、抗体人源化技术及全人源抗体技术逐步走向成熟，治疗性抗体的生产真正进入产业化阶段，越来越多的抗体药物用于人类疾病治疗。

近年来抗体的治疗领域已从传统的肿瘤、自身免疫性疾病逐步扩展到抗感染、代谢性疾病、神经系统疾病、生物安全等新领域，由此出现了很多新靶标。如靶向前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）抗体药物Alirocumab及Evolocumab用于不耐受他汀类药物的人群降低胆固醇，靶向降钙素基因相关肽（CGRP）受体的第一个由美国FDA批准用于预防偏头痛的抗体药物Erenumab，靶向β-淀粉样蛋白的抗体药物Solanezumab用于治疗阿尔茨海默病，靶向C5补体的抗体药物Eculizumab用于治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿，第一个靶向自身免疫球蛋白IgE的抗体药物Omalizumab用于治疗哮喘，靶向表面特异性糖蛋白的炭疽杆菌抗体药物Obiltoxaximab等。

截至2017年5月，获批准上市的分子实体抗体药物达74个，还有数百种治疗性抗体药物处于临床研发阶段。而到2018年底，治疗罕见病——成人获得性血栓性血小板减少性紫癜的抗体药物Caplacizumab经欧盟委员会批准上市，此时获准上市的抗体类药物已达88个。其中2018年获批的抗体药物包括6个人源化抗体药物和5个全人源抗体药物。同时，如何应用现代生物技术进一步提高抗体的效能也是近年来大家关注的热点。除了对抗体本身进行改造（如Fc优化、糖基化改造以增强ADCC）外，ADC药物、双特异性抗体以及基于抗体的细胞免疫治疗等也是治疗性抗体发展的方向之一。当前处于临床试验各期的治疗性抗体药物形式包括抗体、抗体-药物偶联物、双特异性抗体、Fc融合蛋白、放射免疫偶联物、抗体片段、免疫细胞因子等。

重组人多克隆抗体（recombinant human polyclonal antibody）是重组表达的针对人体某种疾病多个抗原的多种单克隆抗体的混合物，能够模拟天然免疫方式，与多种不同的抗原表位结合，因而理论上能触发更多效应，包括调理作用、位阻、中和毒性、凝集或沉淀、激活CDC和ADCC等效应。重组人多克隆抗体几乎兼具抗血清和单克隆抗体的所有优点，在由多抗原表位或者是突变较快的病原体引起的疾病治疗中，将体现其良好的临床应用前景，也是未来抗体药物的发展趋势之一。

此外，阐明抗体-抗原相互作用的模式与其介导生物学效应的关系，探讨能否用相对分子质量较小的支架蛋白甚至小分子化合物模拟抗体的作用等也是值得研究的方向。抗体作为治疗制剂用量较大，因此提高抗体表达量、降低生产成本、提高抗体质量等都是抗体药物发展中亟待解决的问题。