粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）是一种含有174个氨基酸的糖蛋白，相对分子质量约为19000。G-CSF可受内毒素、TNF-α、IFN-γ和IL-1等因素诱导，由单核细胞和巨噬细胞分泌；也可受IL-17的诱导，由上皮、内皮和成纤维细胞分泌；前列腺素E2可以抑制G-CSF的生成。G-CSF具有诱导髓性白细胞系分化为粒细胞和巨噬细胞的作用，是目前已知集落刺激因子家族中最强的诱导因子。人的G-CSF基因全长2.5 kb，位于第17号染色体，包括5个外显子和4个内含子；成熟蛋白含有5个半胱氨酸，分子内的两对二硫键是生物活性的关键结构。
G-CSF主要作用于中性粒细胞系造血细胞的增殖、分化和活化；在体外，可刺激骨髓造血祖细胞中中性粒细胞集落的形成，延长成熟中性粒细胞的存活时间，活化中性粒细胞。重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）临床适应证主要有肿瘤放疗、化疗等原因导致的中性粒细胞减少症，骨髓造血机能障碍等原因引起的中性粒细胞减少症，促进感染或移植后中性粒细胞数升高等。然而，因为rhG-CSF半衰期短（3～4 h），易被酶降解，被肾脏清除，临床应用中需每天注射。通过对rhG-CSF进行聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修饰，可延长其在体内的代谢时间，因此疗效更好。
PEG是一种具有高度柔韧性的亲水性分子，由环氧乙烷聚合而成，其分子式为HO（CH2 CH2 O）nH。利用PEG修饰蛋白，其亲水基团与蛋白质的亲核基团结合，阻止了酶与亲核基团的结合；PEG的高亲水性使蛋白多聚物表面形成一道水化层，降低蛋白质被水解的机会；经PEG修饰后的蛋白质相对分子质量大大超过肾小球基底膜的滤过极限，降低了被肾小球滤过的概率；PEG的柔韧性可以掩盖蛋白质表面的部分抗原决定簇；提高蛋白多聚物的亲水性，降低蛋白分子因疏水性而形成的分子聚集，降低蛋白药物的免疫原性，起到延长蛋白药物体内半衰期的作用。临床上，化疗后PEG-rhG-CSF只需要注射1次，而与此对照，rhGCSF一般2周内每天注射1次，大部分患者注射超过10次。
rhG-CSF常采用原核表达系统（E.coli），蛋白质以包涵体方式表达，经过变性、复性、透析和弱阳离子交换层析后获得弱酸性原液，一般为NaAc-HAc（pH 4.0）缓冲液，蛋白质浓度为1.0 mg/mL。在0.02 mol/L 氰基硼氢化钠（NaCNBH3）条件下，加入4～10倍物质的量比的PEG（相对分子质量大于20000），4℃搅拌过夜，即可实现对rhG-CSF的PEG修饰。该技术的原理是利用蛋白质的N端α氨基与侧链氨基的等电点差，在偏酸性条件下低反应活性的PEG试剂更容易与α氨基发生结合反应，从而实现定点修饰（图2-27）。将修饰后的蛋白质经过层析柱纯化，使其纯度达到98.0%以上，调整合适浓度，加入适量NaAc、聚山梨酯20（或聚山梨酯80）、山梨醇（或甘露醇）等辅料（赋形剂），制备成3.0 mg/mL规格的注射液。每个规格含蛋白药物的活性为1.35×108 IU（采用小鼠NFS-60细胞，MTT比色法检测）。一般有两种包装，分别是安瓿和预装式注射器，并置于2～8℃保存。
图2-27 甲氧PEG丙醛定点修饰rhG-CSF合成路线图
附
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