重组蛋白药物的质量控制策略

（一）重组蛋白药物制备的质量管理系统

生物技术制药的质量管理主要包括三个方面，即质量研究、质量控制与质量保障。

质量研究（quality research，QR）是指针对一个新产品所开展的质量指标的制定，质量检测方法的研究，以及质量标准的确定过程。一般过程为参照类似产品的国家标准和行业标准，对药物质量检测技术方法、考察项目、检测标准进行研究，并与国家指定的质量标准机构合作，开展技术与标准验证。

质量控制（quality control，QC）是指按照确定的质量标准对产品的生产过程与产品的质量进行检测和控制的过程。根据国家审定的质量检测项目、方法与标准对原液、半成品和成品开展质量检测，并对生产过程的内控指标进行检测。所有产品必须符合规定的产品质量标准，国家对生物药物实行“批签发”管理制度。

质量保障（quality assurance，QA）是指保证产品质量满足规定的质量标准所必需的全部活动过程。负责对产品制造全过程的质量进行监控，负责从原料、原液、半成品到成品的取样、留样，监督、检查与确保工序按GMP文件执行，并保证产品生产质量与国家最新药政制度变化做适应性的改进与调整。

重组蛋白药物的原液、半成品、成品一般检测三个方面的指标：理化性质检测指标、相关物质检测指标以及结构分析检测指标。待检样品不论是原液、半成品或成品，后文中按照生物技术药物管理的常规，一律称为供试品。其他对照品或对照组样品，一般依据其不同来源和规定，分别称为标准品、参考品、对照品等。

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（二）质量研究的基本内容

1.理化性质检测指标　常规理化性质检测指标主要包括制品的外观、澄明度、纯度、水分、含量、浓度、生物活性、pH、相对分子质量、等电点等物理、化学、生物学性质指标。

2.相关物质检测指标　相关物质主要有细菌、热原、病毒、残余宿主细胞蛋白质、残余宿主细胞DNA、残余抗生素、残余硫酸铵以及其他生产过程中带入的非配方成分等。

3.结构分析检测指标　结构分析检测指标主要检测蛋白质是否就是所研制的目的蛋白，包括蛋白质印迹分析（Western blotting）、肽图分析、氨基酸序列和圆二色光谱等分析检定项目。

（三）质量检测技术

1.蛋白质浓度检测技术　蛋白质含量检测主要是检测溶液中蛋白质的浓度，最常用的方法有凯氏定氮法、分光光度法、双缩脲法、Lowry法、Bradford法（考马斯亮蓝法）和BCA法。

（1）凯氏定氮法。

凯氏定氮法（Kjeldahl method）是由丹麦化学家Johan Kjeldahl于1883年建立的分析有机化合物氮含量，以及氨或铵中氮含量的常用方法，或者说是测定化合物或混合物中总氮含量的方法。具体原理是在催化剂并加热条件下，用浓硫酸与待测样品作用，氧化分解有机氮转变成硫酸铵；然后在碱性条件下将铵盐转化为氨；氨蒸馏出来后被过量的硼酸溶液吸收，再以标准硫酸或盐酸溶液进行滴定，计算酸消耗量（或采用碳酸钠溶液反滴定未被中和硼酸的方法）确定氨含量，从而确定样品中的氮含量。因为蛋白质中氮含量一般稳定为总质量的16%，所以由此计算蛋白质含量（mg）=氮含量（mg）/16%，或蛋白质含量（mg）=氮含量（mg）×6.25。

目前凯氏定氮法已经发展为常量、微量、平微量凯氏定氮法以及自动定氮仪法等多种技术方法。其优点主要有结果准确，可用于各类蛋白质含量分析，经改进可采用自动定氮仪检测，因而操作相对简单，费用不高。但其不足是精度较差，时间过长，采用多种腐蚀性试剂，而且测定的是总有机氮，不是蛋白质中的氮。

（2）分光光度法。

分光光度法也称为紫外-可见分光光度法。蛋白质分子中含有共轭双键的芳香族氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸）在280 nm波长处具有最大吸收，在一定范围内，吸光度的大小与蛋白质浓度成正比。根据蛋白质的这个性质，将蛋白质稀释到合适的浓度，吸光度与蛋白质浓度呈线性关系。分别测定供试品在280 nm和260 nm波长下的吸光度A280和A260，然后计算蛋白质浓度（mg/mL）=1.45×A280-0.74×A260。因为核酸在260 nm波长处有最大吸收，为消除可能对蛋白质检测值产生的影响，所以一般采取上述公式进行计算。该方法简便快速，但准确度较差，易受较多因素干扰。

（3）双缩脲法。

双缩脲法（biuret method）是鉴定蛋白质的主要分析方法。1847年，Gustav Wiedemann首次制备和研究了双缩脲（NH2CONHCONH2），它是两分子脲加热至180℃左右，放出一分子氨后的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与Cu2+形成紫色络合物，称为双缩脲反应。后发现凡是具有两个酰胺基，或两个直接连接的肽键，或以一个中间碳原子连接的肽键，这类结构的物质均能产生双缩脲反应。蛋白质具有这种结构，所以蛋白质可以和Cu2+形成紫色络合物，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，可通过比色法分析浓度。

双缩脲试剂是一种蓝色的碱性含铜试剂，包括A液（1%氢氧化钾或氢氧化钠）和B液（0.01%硫酸铜和酒石酸钾钠）组成，将供试品加入A液混匀后，加入B液，出现颜色变化，在540 nm波长下检测，鉴定反应的线性区间为5～160 mg/mL。此方法的优点是快速、简便；缺点是灵敏度不高，不适合微量蛋白质的含量测定，结果容易受到硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等物质的干扰。

（4）Lowry法。

Lowry法是在双缩脲法基础上通过添加福林酚（Folin's phenol）试剂以提高分析灵敏度的蛋白质含量检测方法，因1951年Oliver Lowry首次使用该方法发表论文而得以命名；而福林酚试剂是因1951年Otto Folin、Vintil Ciocalteu和Willey Glover Denis首次发表应用磷钼酸盐和磷钨酸盐的混合物测定酚和多酚类抗氧化剂的论文得名（Folin-Ciocalteu reagent，Folin's phenol reagent，Folin-Denis reagent是同义）。福林酚试剂可被蛋白质中的芳烃残基（色氨酸、酪氨酸，半胱氨酸残基也有影响）还原成蓝色化合物，在750 nm、405 nm附近有最大吸收。

Lowry法的试剂包括A1液（2%Na2CO3、0.4%NaOH和0.05%四水酒石酸钾钠），A2液（0.5%五水硫酸铜）和B液（10%Na2WO4·2H2O、2.5%Na2MoO4·2H2O、4.25%H3PO4、10%H2 SO4、15%Li2 SO4、微量液体溴），黄色。蛋白质与碱性铜溶液中的Cu2+络合使肽键伸展，从而暴露酪氨酸和色氨酸，在碱性铜条件下与福林酚试剂反应，产生蓝色；在一定范围内，颜色深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，因不同蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量不同，因此，测定时需使用同种蛋白质作为标准。其中，蛋白质与Cu2+作用生成的Cu+可作为催化剂催化福林酚试剂还原。

Lowry法的优点是可分析微量蛋白质，其灵敏度是双缩脲法的100倍；缺点是使用的试剂多、反应慢、干扰物多（植物样品中的酚类），需控制pH（pH 10～10.5）避免试剂分解，需要在25～30℃水浴中进行，反应30 min后准时检测。

（5）Bradford法。

Bradford法也叫考马斯亮蓝法，是1976年由Marion Bradford建立的。考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）染料在酸性溶液中主要与蛋白质中的碱性氨基酸（如精氨酸和芳香族氨基酸）的残基结合，溶液的颜色由棕黑色变成蓝色，染料最大吸收峰的波长由465 nm变成595 nm。在595 nm波长下，溶液的吸光度A595与蛋白质的浓度成正比，以此确定蛋白质的浓度。蛋白质浓度在1～1000 μg/mL区间接近线性变化。

Bradford法的优点包括方法简单，只需一种显色液；反应迅速，只需一步反应，显色在5 min内完成；干扰少，不受各类电解质、蛋白质保护剂的影响；灵敏度高，最低蛋白质检测限为1μg。缺点主要有两点：考马斯亮蓝变色的主要因素是蛋白质中的碱性氨基酸，不同蛋白质中氨基酸含量不同，因此，检测不同蛋白质会出现一定的偏差；一些表面活性剂和碱性溶液可能会干扰检测结果，标准曲线存在轻微的非线性，只能用标准曲线测定未知蛋白质浓度，不能通过朗伯-比尔定律直接计算。

通常采用的标准蛋白质溶液是1 mg/mL牛血清白蛋白溶液；注意反应过程中SDS浓度低于0.01%，Triton X-100浓度低于0.05%，吐温-20浓度低于0.015%。

（6）BCA法。

BCA（2，2'-联喹啉-4，4'-二羧酸，bicinchoninic acid，二联喹啉酸）法是1985年由Paul Smith发明，是近年来应用最广泛的蛋白定量方法，其原理与Lowry法相似，即在碱性条件下，蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu+。BCA与Cu+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nm波长处有最大吸收，并且与蛋白质浓度成正比。BCA试剂包括试剂A（1%BCA、2%Na2CO3·H2O、0.16%Na2C4H4O6·2H2O、0.4%NaOH、0.95%NaHCO3，pH 11.25）和试剂B（4%CuSO4·5H2O）。

BCA法和前述几种方法相比，具有灵敏度高的特点。蛋白质检测精度范围为0.5～1500 μg/mL，操作简单，试剂及有色复合物稳定性好，适用于表面活性剂存在下的蛋白质含量检测，但受螯合剂和高浓度表面活性剂的影响，一般要求EDTA浓度小于1 mmol/L，β-ME浓度小于10 mmol/L，DTT浓度小于1 mmol/L。BCA法与Lowry法一样，受温度和时间影响较大，需使用相应的缓冲液制备蛋白质标准曲线，并在37℃放置30 min。检测波长一般采用562 nm或570 nm。

表2-8列出上述6种常用蛋白质浓度（含量）检测技术的基本差异。

表2-8　蛋白质浓度检测技术的基本差异

续表

2.蛋白质纯度检测技术　蛋白质纯度检测技术主要有电泳法（SDS-PAGE）和色谱法（HPLC）。

SDS-PAGE技术与HPLC技术前文已分别详细描述，此处省略。国家相关指导原则明确规定了蛋白质的纯度范围，但不能仅满足于新制备出来的供试品符合规定，还必须考虑重组蛋白药物在有效期内的纯度均符合规定。

3.重组蛋白药物生物活性检测技术　重组蛋白药物生物活性检测主要是了解蛋白质在体内所发挥的生物活性，即主要药效，一般包括效价测定（以单位U或国际单位IU表示）和（或）含量测定（以质量表示）。通常采用体外检测或体内检测两类技术。体外检测根据重组蛋白药物的类型，一般有三类：酶类反应、免疫学反应、细胞生物学反应。体内检测主要针对那些引起多种细胞组织反应，或者体外检测技术不足以反映蛋白质的生物学作用的样品。

酶类反应主要应用于各类重组酶药物，如链激酶、组织型纤溶酶原激活剂等；免疫学反应主要应用于各类重组抗体药物和重组蛋白疫苗；细胞生物学反应主要应用于各类细胞因子、融合蛋白、多肽产品。胰岛素等激素类产品主要采用体内法进行活性检测。

（1）酶类活性检测技术。

检测酶活性的方法很多，最常见的有平板溶圈法、发色底物法和血液凝固法等。

平板溶圈法是利用链激酶溶解琼脂平板所含纤维蛋白形成的溶圈大小来判断酶活性的方法。将含有凝血酶、纤维蛋白原、纤溶酶原（根据供试品不同可不加）的琼脂糖倒入平皿凝固成平板，在平板内打孔，孔径为2～3 mm，在孔内分别加入梯度稀释的链激酶供试品、标准品，置湿盒内于37℃放置24 h。纵向和横向量取溶圈直径，各2次，取平均值。以标准品溶液各个稀释度的生物活性的对数对其相应的溶圈直径的对数进行线线回归，求得线线回归方程，根据供试品的溶圈直径的对数求得供试品的生物活性（图2-20（a））。

发色底物法是利用酶解底物释放发色物质从而显色的原理来检测酶活性的方法。将酶的底物与发色物质，如在一定条件下，梯度稀释的供试品与标准品，分别与酶的底物反应，释放PNA，在紫外-可见分光光度计405 nm波长下检测其吸光度，按照标准曲线法或其他统计方法，计算供试品的酶活性。

血液凝固法是利用酶凝固血液的时间或者溶解血液凝块的时间来测定酶活性的方法。一般采用兔或羊的血浆、全血，将相同体积的血液分装于试管中，分别加入梯度稀释的供试品与标准品，检测血液完全凝固的时间来检测凝血酶的活性；或者将血液分装后，加入相同的凝血酶，使其成为血液凝块，然后分别加入梯度稀释的供试品与标准品，分别测定其完全溶解的时间来测定链激酶的活性。这两种方法均需要采用标准曲线法来计算。另外，根据血液凝固和溶解的不同状态来确定酶的活性时，分别采用“++++”“+++”“++”“+”“-”5个等级来记录其活性，这也是一种常用的半定量方法（图2-20（b））。

图2-20　平板溶圈法与血液凝固法

注：（a）平板溶圈法；（b）血液凝固法。

（2）免疫学检测技术。

蛋白质免疫学检测技术主要有酶免疫法、免疫印迹法、免疫斑点法、免疫絮凝法和免疫双扩散法等，主要用于各类抗体、疫苗、抗毒素等重组蛋白药物的效价或活性检测。

酶免疫法（enzyme immunoassay，EIA）是继放射免疫技术与荧光免疫技术之后的免疫技术，具有稳定、简便、快速、无放射性污染以及应用范围广的优点。其中酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）几乎成为生物、医药、临床、农业、司法、环保等各领域蛋白质及其他大分子免疫检测的最重要的技术方法，甚至可应用到一些小分子物质的检测上。依据不同的反应对象和方式，ELISA可以分为双抗体夹心法、间接法、竞争法、捕获法、亲和素/生物素ELISA法等。在生物医药领域，特别是重组蛋白药物的检测一般采用双抗体夹心法。即在一定的固相表面（如96孔板内）包被结合抗供试品的单克隆抗体，加入供试品后，与包被抗体结合；洗去不能与包被抗体特异性结合的其他物质，加入供试品的另一种单克隆抗体（简称二抗）；洗去没有结合上的多余二抗，加入标记了辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）的抗二抗的抗体（酶标抗体，一般为兔抗鼠或羊抗鼠抗体），与二抗结合；洗去没有结合上的多余酶标抗体，加入HRP的底物3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB），TMB被HRP催化显色，加入终止溶液停止反应，在紫外-可见分光光度计的一定波长下检测其吸光度。注意供试品按照一定梯度稀释，分别加入96孔板内，必须设置阳性对照、阴性对照，甚至空白对照，各类样品要平行设置复孔，最后对吸光度进行标准曲线分析，确定供试品中目的蛋白的免疫结合活性（图2-21）。

免疫印迹法（Western blotting）是将含有目的蛋白的供试品进行SDS-PAGE，然后将电泳凝胶中的蛋白条带通过电流作用，转移到硝酸纤维素膜上，在膜上加标记辣根过氧化物酶的抗目的蛋白的抗体，使抗体与目的蛋白在一定条件下结合，再加入酶底物，使酶显色，在目的蛋白条带处出现明显的染色条带。

免疫斑点法（dot blotting）是将含有目的蛋白的供试品，与阴性对照、阳性对照等点在硝酸纤维素膜上，然后在膜上加标记辣根过氧化物酶的抗目的蛋白的抗体，使抗体与目的蛋白在一定条件下结合，再加入酶底物，使酶显色，在目的蛋白点样处和阳性对照点样处出现染色点，而阴性对照不显色。

图2-21　双抗体夹心ELISA法原理示意图

免疫絮凝法（immunoflocculation）是指抗原与抗体在适当的含量、比例、温度、反应时间等条件下，可在试管中发生抗原抗体反应，产生肉眼可见的絮状凝集物。根据抗体或抗原絮状反应标准品可测定供试品的絮状单位值。

免疫双扩散法（immune double diffusion assay）需在琼脂糖凝胶板上按一定距离打7个相同孔径（如Φ=3 mm）的孔，中间1个、周边6个按梅花形式排列，各孔与相邻孔（圆心到圆心）之间距离相同（如6 mm）。若在中间孔中加入抗原，则周边6孔加入不同稀释度抗体；若中间孔加入抗体，则周边6孔加入不同稀释度抗原。加样后，将凝胶板置于水平湿盒内，37℃孵育24 h。若抗原、抗体相对应，浓度适当，则在抗原与抗体孔之间形成一条沉淀线，可以确定供试品。必要时，可用生理盐水浸泡凝胶板，洗去多余未结合蛋白，并采用0.5%的氨基黑溶液染色，再脱色，以提高沉淀线的辨识度。免疫双扩散法结果如图2-22所示。

图2-22　免疫双扩散法结果图

（3）细胞生物学检测技术。(www.xing528.com)

细胞生物学检测方法主要是细胞增殖法，即检测在重组蛋白药物作用下，细胞增加或减少的情况，最常用的是MTT等一类比色法。针对不同的蛋白质，采用不同的细胞株作为试验对象，如重组人白介素-2（rhIL-2）采用IL-2依赖性T细胞CTLL-2，重组人白介素-11（rhIL-11）采用杂交瘤细胞B9-11，重组人粒细胞刺激因子（rhG-CSF）采用小鼠骨髓白血病细胞NFS-60，重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）采用人血液白血病细胞TF-1，成纤维细胞因子类产品采用小鼠胚胎成纤维细胞BALB/c 3T3等；还可以采用一些肿瘤细胞检测抗肿瘤药物的抗肿瘤活性，以二倍体细胞作为正常细胞对照。

MTT是溴化噻唑蓝四氮唑［3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基-2H-溴化四氮唑噻唑蓝，3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide；简称噻唑蓝，thiazolyl blue］的英文缩写。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）可以将MTT还原为甲臜（formazan，不溶于水的蓝紫色结晶）并沉积在细胞中，死细胞无此功能。利用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），或SDS、乙醇、Triton X-100等的酸性溶液溶解甲臜，成为黄色溶液，然后在合适的波长处（一般在500 nm与600 nm之间）测定其吸光度，在一定的细胞数范围内，甲臜量与细胞数成正比。MTT比色法不仅应用于重组蛋白药物活性检测，也在高通量药物筛选、细胞毒试验以及药效学研究中被应用，取代了早期的放射性细胞活性检测技术，具有灵敏度高、安全性好、操作简便和成本低廉的优点。但MTT重复性不够稳定，随后有多种改进技术被应用，如XTT、MTS、WSTs等。

XTT是四氮唑苯磺酸钠［2，3-双（2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基）-2H-四唑-5-甲酰胺内盐，2，3-bis（2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl）-2H-tetrazolium-5-carboxanilide；或称为3，3'-［1-（苯氨酰基）-3，4-四氮唑］-二（4-甲氧基-6-硝基）苯磺酸钠，sodium 3，3-（1-［phenylamino］carbonyl）-3，4-tetrazolium-bis（4-methoxy-6-nitro）benzene-sulfonic acid］的英文缩写。MTS是一种四唑类化合物［3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺酸苯基）-2H-四唑，3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2Htetrazolium］的英文缩写。WSTs（water soluble tetrazolium salts，水溶性四氮唑盐）是一系列水溶性染料，其中应用最多的是WST-8［2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺基苯基）-2H-四氮唑，2-（2-methoxy-4-nitrophenyl）-3-（4-nitrophenyl）-5-（2，4-disulfophenyl）-2H-tetrazolium］。

这三种试剂检测细胞增殖活性的原理与MTT比色法相同，检测步骤基本一致，但它们在吩嗪二甲酯硫酸盐（phenazine methosulfate，PMS）的磷酸盐溶液中，可形成水溶性的甲臜，不需要增溶操作步骤，可以理解为“一步式”检测技术。其中XTT水溶液不稳定，需要低温保存，现配现用；WST-8最稳定，也被称为CCK-8（cell counting kit-8）。MTS比色法的检测波长一般为490 nm，XTT比色法与WST-8比色法的检测波长一般为450 nm。上述实验中，注意设置对照组和实验复孔。

部分神经营养因子类产品生物活性检测技术主要采用鸡胚背根神经节法。采用7～9日龄的合适品种鸡胚，在解剖镜下分离鸡胚的背根神经节，分别置于涂有鼠尾胶的培养皿中，加入不同稀释浓度的标准品与供试品，在细胞培养箱中培养24 h，然后在倒置显微镜下观察背根神经节神经轴突生长状况，根据其轴突的长度、密度等分别标记为“++++”“+++”“++”“+”“-”5种不同的生长情况，与标准品对比，确定供试品生物活性。这只是一种半定量方法，而且随检定者个人主观判断会出现误差。一种改进专利方法是将9～10日龄合适品种鸡胚背根神经节进行消化分散成原代细胞，利用活细胞溶酶体中普遍存在的酸性磷酸酶（acid phosphatase）可以将底物对硝基苯磷酸酯（p-nitrophenyl phosphate，pNPP）催化生成黄色的对硝基苯酚（p-nitrophenol）的原理，该物质在405 nm波长处具有特性吸收峰，加入NaOH终止酶反应后，黄色溶液可以稳定一段时间，以此来检测神经营养因子对神经节原代细胞的促存活作用，可实现客观量化的检测结果。表2-9为常见的蛋白质生物活性细胞检测方法。

表2-9　常见的蛋白质生物活性细胞检测方法

续表

除了上述MTT类、酸性磷酸酶等活性定量方法外，通过显微镜观察供试品的特异性促进（抑制）细胞生长（病变）作用，也可以实现定性或半定量的活性检查；或者加入特定受体报告基因、荧光结合染料等，通过流式细胞仪来定量检测供试品的生物活性。

（4）体内活性检测技术。

将一定稀释浓度的供试品对动物进行给药，检测动物体内生物学变化，与标准品比较来确定供试品的生物活性。如注射用重组蛋白疫苗，测定动物体内的抗体滴度；注射促红细胞生成素（erythropoietin，EPO，或称促红素），眼眶取血检测小鼠网织红细胞占总红细胞比值的变化；注射毒素、抗毒素与毒素混合液，观察动物（通常为小鼠）死亡时间与数量，确定毒素或抗毒素的生物活性。

由于动物体内实验时间长，成本高，个体差异大，尽量采用体外方法替代。

4.澄明度检测方法　澄明度（或称澄清度）检查是将重组蛋白药物制剂溶液与规定的浊度标准液（表2-10）进行比较，以检查其澄清程度。检测浊度（澄清度）一般有目视法与仪器法两种。

表2-10　浊度标准液基本配方

目视法具体操作：室温下将样品用水稀释至一定浓度，与等量的浊度标准液分别置于配对的比浊管（无色透明的中性硬质玻璃制成的内径15～16 mm带塞平底管）内，在暗室内垂直置于照度为1000 lx的伞棚灯下，从水平方向进行观察和比较样品溶液与标准品溶液的浊度。浊度标准液系列包括浊度标准储备液、浊度标准原液和浊度标准液。浊度标准储备液由1.00%硫酸肼溶液和10%六亚甲基四胺（乌洛托品）溶液等体积混合配制而成。乌洛托品易水解生成甲醛，甲醛与肼缩合成甲醛腙，为白色浑浊，故以此制作浊度标准储备液。浊度标准原液由15.0 mL浊度标准储备液精确稀释成1000 mL而成。浊度标准原液在550 nm波长下的吸光度应为0.12～0.15，并在配制后48 h内使用。浊度标准液按表2-10在临用时取浊度标准原液加水稀释而成，应在配制后5 min内使用。供试品则应在溶解后立即检视。一般情况下，重组蛋白药物样品溶液应澄清。“澄清”是指供试品溶液的澄清度与其溶剂相同，或不超过0.5号浊度标准液的浊度；“几乎澄清”是指供试品溶液的浊度介于0.5号与1号浊度标准液的浊度之间。

仪器法即采用澄明度检测仪（浊度仪）来检测样品的澄清度。样品溶液中各类大小、特性不同的微粒物质或有色物质均可使入射光产生透射或散射，测定透射光或散射光的强度即可检测样品溶液的浊度。因此，一般有透射光式、散射光式和透射光-散射光比较三种测定模式。以散射光浊度仪为例，光源峰值波长约为860 nm，测量范围为0.01～100浊度值（nephelometric turbidity unit，NTU），0.5号～4号浊度标准液浊度值范围为0～40 NTU。入射光与散射光方向有90°，检测的散射光强度I=K'TI0，其中，K'为散射系数，T为样品溶液浊度，I0为入射光强度。在入射光强度不变的情况下，散射光强度与样品溶液浊度成正比，浊度检测可转化为散射光强度检测。按照浊度仪说明书要求进行仪器校正和样品溶液浊度测定，浊度可直接读出。为保证样品浊度测定的准确性，需定期对浊度仪进行浊度标准液的线性和重复性考察。

5.相对分子质量检测方法　蛋白质相对分子质量的鉴定方法主要有SDS-PAGE、分子筛层析法、质谱分析法以及其他适当技术等。

在检测中均需要设置蛋白质相对分子质量标准品作为对照，并与蛋白质表达工程细胞构建中目的基因DNA相对分子质量进行对照分析。

6.等电点检测方法　采用等电聚焦电泳法检测重组蛋白的等电点。等电聚焦电泳法是采用两性电解质在电泳场中形成pH梯度，作为两性电解质的蛋白质所带电荷与电泳介质的pH有关，带电荷的蛋白质在电泳中向极性相反的方向移动，当到达其等电点时，蛋白质不带电荷，因此停下来不再移动，此处pH即为供试品的等电点。

一般采用恒压或恒流电源，带有冷却装置的垂直电泳槽。电泳介质为丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺，加上过硫酸铵配制而成。其与其他丙烯酰胺凝胶电泳的不同之处主要在于样品缓冲液中含有40%左右的两性电解质，可以在电场中形成稳定的pH梯度；另外采用涵盖供试品等电点范围的等电点标准品作为对照。

7.无菌检测技术　用于检查生物技术药物是否无菌的技术方法，要求在无菌条件下进行，如试验环境（一般要求洁净工作台）、各类器具、试剂等，检验过程应严格遵守无菌操作规范。定期对试验环境进行悬浮粒子、浮游菌、沉降菌标准验证，必须符合无菌检查要求。

无菌检测技术常用的培养基有硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基等，均可用于检测厌氧菌、需氧菌、真菌等。对上述培养基首先要进行适用性检查，即对培养基进行无菌性检查和灵敏度检查，无菌性检查是指每批培养基随机抽取不少于5支（瓶），将其置于规定温度下培养14天，无细菌生长。灵敏度检查是将按规定制备的各种阳性菌液接种检查用培养基，当空白对照管无菌，加菌管细菌生长良好时，即可判定培养基灵敏度检查合格。

用来制作阳性对照菌液的菌种是来自国家菌种保藏中心的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉等，正式检测供试品前，还需要进行方法适用性试验（可与供试品无菌试验同时进行）。将供试品进行除菌过滤，用冲洗液冲洗滤膜，将冲洗液与适量阳性菌液混合后，再过滤除菌，在过滤器滤筒（含被拦截细菌）加入适宜培养基，置于适宜温度下培养5天以上，称为薄膜过滤法。将薄膜过滤法培养菌与直接将阳性菌液接种到同样的培养基上的培养结果进行比较，当两种方法细菌均生长良好时，说明供试品不具有抑菌作用或抑菌作用可忽略。如果薄膜过滤法培养细菌不生长，或生长状况明显不如直接接种法培养的细菌，则说明供试品具有明显的抑菌作用。应采用增加薄膜冲洗次数、冲洗液中加入中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，重新开展方法适用性试验。

供试品无菌试验需采用薄膜过滤法与直接接种法进行培养基接种，针对不同制剂、临床给药途径、单支分装剂量、单批产量等因素，抽取不同数量的样品，分别接种于上述各类培养基，设定好空白对照、阴性对照（相应溶剂或稀释液）、阳性对照。对于有真空度的供试品容器，要导入无菌空气后再开启容器取样。当阳性对照管菌生长良好，阴性或空白对照管中无菌时，则试验有效；当供试品管均澄清，或浑浊但确证无菌生长时，则供试品符合规定；当供试品任何一管确证有菌生长时，则样品不合格。

8.病毒检测技术　在哺乳动物细胞培养过程中，一般采用病毒载体转染技术，有可能造成外源病毒因子的污染，除了在蛋白表达制备过程中设立去除/灭活病毒的技术工艺环节外，在病毒种子批、生产用细胞、产品原液和成品质量检测中，必须进行外源病毒因子的检查。病毒种子批采用动物（小鼠、乳鼠）接种法、细胞培养法（非血吸附病毒、血吸附病毒检查）以及鸡胚检查法进行外源因子检查；生产用细胞采用非血吸附病毒检查（细胞直接观察、细胞培养试验）和血吸附病毒检查法检查外源因子；产品原液与成品可根据生产制备过程可能涉及的不同病毒因素，分别采用PCR法、逆转录扩增法、免疫法、细胞培养法、鸡胚检查法、动物接种法，或猴体神经毒力试验法等。下面介绍最主要的动物接种法、鸡胚检查法和细胞培养法。

动物接种法即在动物脑部和腹腔接种一定剂量的经抗血清中和后的病毒种子批，培养21天后，对出现死亡或患病动物进行解剖，观察其病理改变。

鸡胚检查法是将经抗血清中和后的样品，分别接种9～11日龄和5～7日龄两组SPF级鸡胚（10枚鸡胚/组）的尿囊腔和卵黄囊中，每枚0.5 mL。35℃孵育7天，观察鸡胚存活情况；同时取尿囊液和红细胞混悬液进行血细胞凝集试验。鸡胚每组存活80%以上，血细胞凝集试验结果为阴性者为合格。

细胞培养法是选择对被检病毒敏感的细胞，每瓶细胞分别接种供试品0.3 mL，供试品接种4瓶，设2瓶对照。37℃培养1h，更换细胞培养液。每天观察细胞形态，以后每隔3～4天换1次液。细胞维持培养10～14天，将对照组2瓶、供试品组4瓶分别合并，将收获的细胞悬液分别接种同种细胞，每隔3～4天换1次液，培养10～14天，显微镜下观察没有出现细胞病变即为阴性。另外有些细胞需要检测血细胞吸附病毒，则将0.2%～0.5%的鸡和豚鼠的红细胞混合液，加入上述细胞培养液中，一瓶细胞置于2～8℃放置30 min，另一瓶细胞置于20～25℃放置30 min，分别吸去多余的红细胞悬液，显微镜下观察细胞吸附红细胞的情况。对于明确需要检测的病毒，还可以通过加入荧光标记的病毒抗体，通过观察是否有荧光来确定病毒的存在。

9.支原体检测技术　支原体是细胞最常感染的微生物，感染了支原体的细胞一般不会出现细胞死亡、培养基浑浊的现象，但是细胞性状会发生改变，进而不能真实反映药物作用于细胞后的生物学功能，甚至会感染重组蛋白药物。一般细胞库细胞、病毒种子库、对照细胞，以及临床免疫细胞治疗用的细胞均应进行支原体检查，要求同时采用培养法和DNA染色法（指示细胞培养法）检测。

培养法：常用支原体培养基有支原体液体培养基（支原体肉汤培养基、精氨酸支原体肉汤培养基）、支原体半流体培养基和支原体琼脂培养基三种。支原体肉汤培养基主要成分为猪胃消化液（500 mL）、牛肉浸液（500 mL）、酵母浸粉（5.0 g）、氯化钠（2.5 g）、葡萄糖（5.0 g）和酚红（0.02 g），pH为7.6左右；精氨酸支原体肉汤培养基、支原体半流体培养基和支原体琼脂培养基为在此基础配方上分别加入L-精氨酸（2.0 g）、琼脂（2.5～3.0 g）和琼脂（13.0～15.0 g）；支原体培养基使用前应高压灭菌。采用支原体标准菌株对培养基进行灵敏度检查；检查合格的培养基按体积加入25%的灭活小牛血清，然后分装培养基，规格为10 mL/支，每支接种0.5～1.0 mL样品，不同培养基各接种4支，置于36℃培养21天；第7天从每4支液体培养基中各取2支进行次代培养，将培养液分别转种至相应的半流体培养基及液体培养基中，置于36℃培养21天；每3天观察1次，如果出现变色反应即表示有支原体污染，为不合格，反之为合格。

DNA染色法：将供试品接种于经国家药品检定机构认定的无污染细胞（指示细胞）中培养，然后加入二苯甲酰荧光染料（Hoechst 33258）进行染色，如果污染了支原体，可以在荧光显微镜下观察到细胞表面有特异性的绿色荧光，这是因为染料嵌合到支原体的DNA中出现的着色。注意设置阴性与阳性对照，阴性细胞仅在细胞核部位有规则的较暗的黄绿色荧光，阳性细胞则在细胞周边出现各种不规则的较强的绿色荧光。

10.热原检测技术　通常采用家兔法或鲎试剂法（limulus amebocyte lysate，LAL）进行热原检测。

家兔法：选择健康无病，体重为1.7～2.5 kg的家兔。试验前观察3天无异常，未曾开展过热原试验的家兔还需要进行体温筛选，以温度计或测温探头插入家兔肛内约6 cm并保持2 min以上，间隔1h测1次，连测4次，体温应保持在38.0～39.8℃，最高与最低体温相差不超过0.5℃。开展过热原试验的家兔，休息48 h后可重复使用。所有试验用的器具、试剂必须保证无热原，温度计或测温探头的精确度为±0.1℃，保持试验环境温度为15～25℃，试验过程环境温差不得超过3℃，保持安静，无刺激性气味，避免强光照射。每个供试品采用3只家兔进行试验，复试采用5只。试验前禁食2h，间隔30～60 min测两次体温，温差不得大于0.2℃，两次体温均为正常体温，同组3只家兔正常体温温差不得大于1.0℃。第二次测温后15 min内，按照规定剂量自家兔耳缘静脉缓慢推注预热至38℃的供试品，然后每隔30 min测温1次，连测6次。若最后两次测温升温超过0.2℃或降温超过0.4℃，需继续测量。按照表2-11进行结果判定。

表2-11　家兔法热原检测结果

鲎试剂法是家兔热原试验的体外代替方法。1956年，Fred Bang首次报道海洋生物鲎体内有一种阿米巴样细胞内凝固酶（或称阿米巴样细胞裂解物），此酶可与革兰阴性菌的脂多糖（LPS）发生反应形成凝块。LAL是从美洲鲎血液中提取的一种鲎试剂，另一种从东方鲎血液中提取的东方鲎鲎试剂（tachypleus amebocyte lysate，TAL）与LAL有相同功效。鲎试剂是由鲎血细胞裂解物经氯仿处理去除抗脂多糖因子，并加入适量Ca2+、Mg2+等制成。使用过程中注意加入阳性对照、阴性对照，按照试剂表明的热原灵敏度来检测。另外，也有人采用鲎试剂浊度法或显色基质法等光度测定法来检测热原，当结果出现争议时，以凝胶法结果为准。

部分细胞因子本身在人体内具有致热作用，不适宜采用家兔法检测，只能采用鲎试剂法检测。一般要求每剂量不得高于10 EU，个别临床用量较低的产品热原含量不得高于2 EU。

11.残余宿主细胞蛋白检测方法　宿主细胞蛋白（host cell protein，HCP）是指构建工程细胞所采用的宿主表达细胞，如大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞等的蛋白，这些残留的蛋白可能会对重组蛋白药物的安全性和药理作用产生影响，因此需要确认其在最终药品中的含量。

通常采用ELISA法来检测残余的HCP含量，可以购买专门的检测试剂盒对供试品进行检测，也可以采用产品表达用宿主细胞来制备标准蛋白样品和单克隆抗体，来检测残余HCP。一般要求HCP在供试品中的含量不高于0.1%。

12.残余DNA检测方法　对外源性残余DNA的检测可以根据供试品的不同情况分别采用DNA探针杂交法、荧光染色法。

采用饱和苯酚/三氯甲烷抽提法从宿主细胞提取DNA，并经分子筛纯化，一部分DNA用作阳性对照，另一部分经过机械剪切和（或）超声波处理使DNA断裂成小片段，然后采用地高辛标记与检测试剂盒将DNA片段标记成探针待用。利用蛋白酶K对供试品（重组蛋白）、不同浓度阳性对照（DNA）、阴性对照（非同源DNA）进行蛋白裂解预处理，然后采用饱和苯酚溶液提取DNA。将样品DNA与各种对照DNA（包括阳性对照梯度稀释系列）沸水浴加热，然后冰浴变性后，点样到杂交膜上，晾干后采用紫外或加热方式使DNA交联。加DNA探针，经孵育杂交，按照试剂盒说明分别加入抗地高辛的抗体和化学发光底物或酶底物，通过与阳性对照梯度稀释系列斑点颜色浓度对比，确定供试品中宿主细胞残余DNA含量。通常要求残余DNA含量每次治疗剂量不得高于10 ng，部分产品已经提升到每次治疗剂量不得高于100 pg的标准。

13.残余抗生素检测方法　抗生素是由微生物或高等动植物所产生的具有抗病原或其他活性的一类次级代谢产物，包括β-内酰胺类（青霉素、头孢菌素），氨基糖苷类（链霉素、庆大霉素、卡那霉素），酰胺醇类（氯霉素、甲砜霉素），大环内酯类（红霉素、白霉素），多肽类（多黏菌素B、多黏菌素E、杆菌肽、短杆菌肽、万古霉素），喹诺酮类（诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、氟罗沙星），磺胺类（磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺异噁唑、磺胺甲噁唑）及其他抗生素。

人用药品注册技术要求国际协调会（International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration Pharmaceuticals for Human Use，ICH）将生物制品中的残留抗生素列为工艺相关杂质，要求通过研究证明其在工艺中可有效控制或去除，并达到可接受的水平。

根据《中国药典》（2015年版）三部凡例十六，生产过程中抗生素和防腐剂使用的相关要求：①除另有规定外，不得使用青霉素或其他β-内酰胺类抗生素；②成品中严禁使用抗生素作为防腐剂；③生产过程中，应尽可能避免使用抗生素，必须使用时，应选择安全性风险相对较低的抗生素，使用抗生素的种类不得超过1种，且产品的后续工艺应保证可有效去除制品中的抗生素，去除工艺应经验证；④生产过程中使用抗生素时，成品检定中应检测抗生素残留量，并规定残留量限值。

重组蛋白药物在工程细胞种子构建和保藏中可以有限度地使用抗生素，但是在重组蛋白药物生产过程中严格禁止使用，在质量检定分析中设立残留抗生素检定指标。目前，残留抗生素的检测方法主要有三种：微生物学法、免疫学法和色谱法。

微生物学法是利用抗生素对敏感细菌可产生抑制作用的原理来检测，在药物杂质检测中被广泛采用，主要包括杯碟法、棉签法、纸片法和琼脂扩散法等，定量检测灵敏度为0.5 mg/g，不足是耗时长、操作烦琐、易受干扰。免疫学法是利用抗生素与其抗体特异性结合的原理来检测，包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光免疫检测（FIA）和放射免疫测定（RIA）等，检测灵敏度可达到1 ng左右，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。色谱法是对残留抗生素定量分析的方法，包括高效液相色谱（HPLC）、毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）和质谱法等。

14.残余硫酸铵检测技术　硫酸铵是蛋白质分离纯化中进行浓缩分离的最常用试剂，而且蛋白质在饱和硫酸铵溶液中可以得到较好的保护，因此，只要采用硫酸铵盐析或浓缩过程的工艺流程，均需要对硫酸铵残余含量进行检测，一般均采用前述凯氏定氮法检测样品中硫酸铵的含量。

15.蛋白印迹检测技术　蛋白印迹（或称蛋白免疫印迹）检测技术主要用于检测重组蛋白表达粗品与分离纯化后纯品中目的蛋白，通过确定其与抗体的结合反应起到对目的蛋白性质的鉴别作用，也可以实现一定精确度的定量或半定量，或作为蛋白质免疫活性的检测方法。具体技术方法见前述蛋白质生物活性检测技术中的免疫印迹法。

16.肽图分析（peptide mapping）　通过蛋白质水解酶（主要是肽链内切酶，常用胰蛋白酶、糜蛋白酶、Asp-N、Glu-C、Lys-C和Lys-N 6种酶）裂解蛋白质成为多条短肽，然后采用反相高效液相色谱法分析，得到各肽峰形图。对于同一种蛋白质，其氨基酸排列顺序是固定的，采用特定的酶所裂解得到的多肽峰形图必然是确定的，这是蛋白质的重要物质特性。最常采用胰蛋白酶来水解蛋白样品，反相高效液相色谱多采用辛烷基硅烷键合硅胶或十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱填充剂。检测后的色谱图与对照品图谱进行比较，色谱图完全一致为合格。

也可采用溴化氰/甲酸裂解液裂解蛋白，然后进行SDS-PAGE，染色脱色后的电泳图谱与对照样电泳图谱进行比较，这个方法相对蛋白水解酶法和反相高效液相色谱法而言，灵敏度较差。

17.氨基酸序列分析技术　重组蛋白药物氨基酸序列分析主要指对蛋白N末端的15个氨基酸序列的测定，并与该蛋白理论序列进行比较。有多种方法通过水解蛋白成小的肽段或氨基酸残基来分析，其中最常采用的是Edman降解法（Edman degradation）：将有机试剂异硫氰酸苯酯（phenylisothiocyanate，PITC）和蛋白N末端的α-氨基反应，使N末端的第一个氨基酸从序列上断裂获得游离的PITC衍生氨基酸，并且第二个氨基酸残基的α-氨基暴露出来；通过对断裂下来的PITC衍生氨基酸进行HPLC分离，根据保留时间来判断该氨基酸的种类。现在蛋白质的氨基酸序列分析工作均采用氨基酸序列自动分析仪来完成。

注意，在进行蛋白质的氨基酸序列分析时，供试品的纯度不得低于97%，通常N末端没有特殊修饰导致α-氨基被封闭。在重组蛋白药物注册申报时，N端的15个氨基酸序列通常是必检项目，也是很多已上市药物的年检项目。部分重组蛋白药物还必须提供C末端3～5个氨基酸的序列，或者提供蛋白质的氨基酸组成分析信息。

18.圆二色光谱分析技术　光是横向电磁波，其电场矢量与磁场矢量相互垂直，并与光波传播方向垂直。光波电场矢量与传播方向组成光波振动面，不随时间变化的光称为平面偏振光，可以分解为按逆时针、顺时针方向旋转的左旋、右旋圆偏振光，偏振光也可以合成一束平面偏振光。蛋白质对左、右旋圆偏振光的光吸收率不同，称为蛋白质的圆二色性（circular dichroism，CD）。通过蛋白质传播的平面偏振光变成椭圆偏振光，并只能在发生吸收的波长处才能够观察到其长轴、短轴之比（或椭圆率）。椭圆率与波长之比形成的关系曲线称为圆二色光谱曲线，是供试品的结构特征曲线，也是研究蛋白质二级结构和立体构型的重要方法之一。

（四）质量标准的确立

根据国家药典和有关指导原则的要求，结合重组蛋白药物的表达体系、制备工艺、给药剂型和临床用量，特别是蛋白质本身的性质，设立全面、准确反映药物安全有效质量可控的有关质量检测指标（包括蛋白药物的理化性质、相关物质、生物学特性和结构鉴定等）及其具体检定分析项目，确定科学合理的检定分析方法。对于涉及药物特性的项目检定分析方法，其准确性和可靠性需要进行验证。

一般情况下，需验证的检定分析项目包括鉴别试验、杂质检查、生物活性测定和含量测定。必要时，其他部分检定分析方法也需要验证。重组蛋白药物的鉴别试验大多采用免疫印迹检测法；杂质检查包括定量检查项目和限度检查项目。对于已有国家标准，或世界卫生组织推荐的鉴定分析方法，已经被确定为标准方法，均经过适当的验证过程，在首次采用此方法时，可进行专属性和精密度的验证。对于标准方法的替代方法、来自参考文献的方法和自行建立的方法，一般需要进行全面、严格的验证，以表明方法的科学合理性。

重组蛋白药物质量控制的检定分析方法与其本身性质、制备技术密切相关，因此在进行方法验证时，需全面分析有关信息，包括方法的原理、蛋白样品与制样、检测仪器、试剂来源、标准品（参考品）、检测过程、数据计算、结果报告以及判定标准。针对需要验证的项目，是对其具体检测方法的专属性、准确性、精密度（包括重复性、中间精密度、重现性）、线性、耐用性、范围、检测限度和定量限度等指标中的部分指标进行测定（表2-12）。

表2-12　质量检定方法与标准验证指标

对于自建的质量检定分析方法，在完成自我验证后，还需要与中国药品生物制品标准化研究中心共同开展对方法的验证，才能成为该产品的质量检定分析方法。只有经3个以上无关联实验室协作研究验证，获得明确的重现性，才有可能被采用为法定标准。