重组蛋白药物制剂研究

具有生物活性的蛋白质分子通常具有三级甚至四级结构，相对于小分子药物而言，蛋白药物具有相对分子质量大、结构复杂、不稳定等特点。蛋白质分子内部或分子之间通过共价键结合，容易出现变形、聚集、沉淀、表面吸附等物理变化，以及共价键断裂或新共价键形成而变成新物质的化学变化。对蛋白质稳定性影响较大的因素有温度、光照、pH、超声波、高频振荡、变性剂、有机溶剂和蛋白酶等。因此，必须采用合适的药物制剂方式以提高重组蛋白药物的体内、外化学稳定性，从而达到维持生物活性的作用，最常采用密封、低温和保护剂等方式。重组蛋白药物一般不采用口服给药，而采用静脉或肌内注射、黏膜吸收、皮肤给药等给药途径。

（一）重组蛋白药物常用剂型

1.注射液　注射液是重组蛋白药物制剂的常见剂型之一，主要用于肌内注射、皮下注射、静脉注射与局部注射，一般多为小容量注射液，大容量注射液仅用于静脉滴注，要求不小于50 mL。常采用中性盐缓冲液，如碳酸、磷酸、醋酸缓冲液等作为溶剂，或加入一些糖（蔗糖、海藻糖、葡聚糖、羟乙基淀粉等）、醇（山梨醇、甘露醇等），以及氨基酸、白蛋白等成分，不加或尽量少加增溶剂、助溶剂、等渗调节剂、乳化剂、吸附剂、络合剂等成分。鉴于动物源性成分的辅料将会逐步被禁止使用，故在注射液制剂配方中尽量不用白蛋白等成分。

注射液采用玻璃管制瓶（西林瓶）作为容器，溴化丁基橡胶塞材料制成胶塞，胶塞外采用铝盖夹紧固定。部分采用笔式注射器等预充式注射剂，以方便患者使用。

2.冻干制剂　冷冻干燥是将样品溶液冷冻成固体，在低温低压乃至真空条件下利用水分升华的特性，使样品低温脱水成为干燥样品的方法。在此过程中，热能通过与样品接触的壁面传导，样品中的固态水分（冰）发生气化并随低压或真空环境中的气流带走。一般样品溶液中会添加可形成支架的物质辅料，以保证样品的溶质留在支架中，在干燥过程中体积不会变化，形成疏松多孔的结构，该结构在水分升华时吸收热量。在升华过程中，样品温度降低，将减慢升华的速度，因此在冻干过程中会适当提升温度以加快升华干燥过程。

整个冻干过程均是在低温、低压下进行的，这样有利于重组蛋白不发生变性失活，且真空下样品不易氧化。重组蛋白药物可以在支架的支撑下，保持其在溶液中的空间构型，这是保证蛋白质生物活性的重要特点，而且其干燥后的疏松多孔结构易于加水溶解。冻干制剂的不足是制备时间较长、成本较高、不能制备特殊晶型，在复溶时部分样品可能出现浑浊现象。

对于蛋白质样品的冻干制剂，最常用的辅料（赋形剂）主要有糖（蔗糖、海藻糖、葡聚糖、果糖和羟乙基淀粉等）、醇（山梨醇、甘露醇、肌醇等）、氨基酸、蛋白质（白蛋白等）、明胶肽以及盐等物质，或者这些物质的混合物。一般赋形剂不超过3种；部分具有药理作用的赋形剂尽量采用较低浓度，以不影响重组蛋白药物的药理作用为宜；尽量采用已获批可用于注射液的赋形剂，否则需要与重组蛋白药物同时申报新型辅料，增加开发成本。

最常用的冻干设备有实验室冻干机，一般不具备预冻功能，也不能绘制冻干曲线。生产或中试用的冻干机，可将样品溶液冷冻至-55℃以下，在冷冻干燥过程中，可以全面记录传温隔板、测试样品瓶中样品的温度、真空度等数据，绘制冻干曲线，为产品制备提供重要的参考数据。冻干机的规模一般以传温不锈钢隔板的面积来划分，通常0.5 m2以上面积的冻干机为中试以上规模。绝大部分冻干机具有手动或自动压盖功能，部分冻干机还具有填充惰性气体或氮气的功能，以保证样品容器中的真空或充气效果。

冷冻干燥的一般流程：先将灌装样品溶液高度不超过1 cm的样品瓶（一般为胶塞西林瓶，或称管制瓶）虚盖上胶塞，让瓶内外空气可自胶塞叉脚间的导气槽自由流通。置于-50℃以下低温冷冻，大约4h后，开始抽真空，同时适当回温至-20℃左右，这个过程一般持续18～24 h，部分产品可能更长。根据整个冻干工艺时间，在结束前10 h左右，将隔板温度升至30℃左右，此时样品中水分极少，且升华过程中的气态水分也极少，因此，一般不会影响蛋白质的稳定性。结束前，直接压紧胶塞，或充入惰性气体后压紧胶塞。降低环境温度至室温，在胶塞外加盖铝盖并夹紧固定。

冻干后的蛋白质样品应呈白色疏松固体状，要求水分含量低于3%。因考虑胶塞内网孔可能含有水分，除了胶塞湿热灭菌后需要长时间烘干外，还要考虑样品保存期可能吸收胶塞内残存水分，所以冻干后的新制品中水分含量应该更低。如果冻干后的样品发黄、不能成型，或者复溶时间过长、出现浑浊现象，需要调整制剂配方和冻干技术参数。

3.凝胶剂　重组蛋白药物凝胶剂是指重组蛋白加入能形成凝胶的辅料，支撑具有凝胶特性的黏稠液体或半固体制剂，主要应用于皮肤或体腔等局部给药。重组蛋白药物凝胶剂主要采用水性凝胶，其基质属于单相分散系统，一般采用水、甘油、丙二醇、纤维素衍生物、卡波姆、海藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、淀粉等物质作为辅料；小部分采用油性凝胶或混悬凝胶，主要采用液体石蜡、聚乙烯、脂肪油、卵磷脂、铝皂、辛皂等作为辅料。

在生产与储存过程中，要求凝胶剂均匀、细腻，密闭、避光保存，在常温下保持胶状，不得出现液化或干涸现象，具有一定防冻性能。必要时可加入保湿剂、抑菌剂、抗氧化剂、乳化剂、增稠剂、透皮吸收剂等，为保证重组蛋白药物的稳定，凝胶剂应采用无菌制剂。

4.喷雾剂　重组蛋白药物喷雾剂是指将重组蛋白与适宜的辅料填充于特制装置中，使用时通过手动泵的压力、高压气体或其他方法将药剂以雾状物形式释出，用于肺部吸入、口鼻腔黏膜给药或皮肤给药等。药剂可以是溶液型或乳液型，如果采用一些新型的药物输送系统，也可制备成混悬液型。给药途径常分为吸入喷雾剂、鼻腔或口腔喷雾剂、皮肤喷雾剂。主要是定量喷雾剂，对于手压泵的精确度和重复性要求非常高；也可以是非定量喷雾剂，如皮肤喷雾剂等。(www.xing528.com)

喷雾剂的生产需要在一定的洁净度、灭菌条件和低温环境中进行；喷雾装置和容器的材料应无毒、无刺激性、性质稳定，不与重组蛋白药物、辅料发生作用。溶液、乳液应澄清，混悬液应均匀；经雾化器产生的雾滴大小应控制在10μm以下，其中大部分小于5μm；定量吸入喷雾剂应为无菌制剂。根据药物性质，一般要求密闭、低温、避光条件下储存。根据需要，可以适当加入助溶剂、抗氧化剂、抑菌剂和表面活性剂等，这些附加剂不得对黏膜或皮肤产生刺激。

5.栓剂　重组蛋白药物栓剂是指重组蛋白与适宜的基质按照一定技术工艺制备的可供腔道给药的固体制剂，一般为直肠栓、阴道栓和尿道栓等。直肠栓常为鱼雷形、圆锥形、圆柱形等；阴道栓常为鸭嘴形、球形或卵形等；尿道栓一般为棒形。栓剂基质主要有脂肪酸甘油酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、可可豆脂、氢化植物油、甘油明胶、帕洛沙姆、聚乙二醇等物质。

采用挤压法或模制法制备栓剂，外形应光滑完整，室温下保持适宜的硬度；对腔道黏膜无刺激性，可以软化、融化或溶化，与腔道分泌液混合后释放重组蛋白药物，产生局部或全身作用。栓剂内包装材料应性质稳定，无毒性或刺激性成分，不能与重组蛋白药物或基质发生理化作用。储存和运输过程温度应该控制在30℃以下，防止栓剂受热、受潮，出现变形、变质、发霉等情况。

6.膏剂　膏剂包括软膏剂与乳膏剂。重组蛋白药物软膏剂是指重组蛋白与水性或油性基质混合制成的均匀半固体外用制剂，分为溶液型和分散型软膏剂；蛋白药物乳膏剂是指重组蛋白溶解或分散于乳液型基质中形成的均匀半固体外用制剂，分为水包油型乳膏剂和油包水型乳膏剂。软膏剂常用聚乙二醇水性基质，或凡士林、液体石蜡、硅油、硬脂酸、羊毛脂、硅油等油性基质；乳膏剂常用脂肪酸硫酸酯钠、三乙醇胺皂类、聚山梨酯等水包油型乳化剂，或羊毛脂、脂肪醇、钙皂、单甘油酯等油包水型乳化剂。

膏剂必须均匀、细腻，不溶性原料应预先制成细粉，确保粒度符合规定；应有适当的黏稠度，易于涂布到皮肤或黏膜上，黏稠度应随季节、环境变化小；可适当加入保湿剂、增稠剂、稀释剂、抗氧化剂、抑菌剂、透皮促进剂等，且对皮肤、黏膜不具有刺激性；一般要求避光、密封保存，乳膏剂要求在25℃以下储存；不得出现酸败、异臭、变硬、变质、变色等现象。

（二）重组蛋白药物容器的质量要求

重组蛋白药物大部分采用注射液和冻干针剂，较少采用其他剂型。本章主要描述注射液与冻干针剂的容器和包装。

一般注射用针剂采用安瓿和管制（玻璃管制作）西林瓶作为容器，现在越来越趋向以西林瓶为主。相对而言，冻干针剂采用西林瓶更多。西林瓶瓶颈部通常较细，瓶颈以下呈圆柱形，瓶口略粗于瓶颈，略细于瓶身。最常见为无色透明或棕色透明玻璃材质，以胶塞封口，外加盖铝盖，夹紧固定防止胶塞松落。安瓿为密封的薄玻璃小瓶，颈部较细，使用时以颈部敲碎或砂轮划线后掰断的方式开启，易导致碎玻璃进入药物。

制作注射用针剂瓶的玻璃有中硼硅玻璃和高硼硅玻璃，线胀系数小，热稳定性好，硬度大，耐磨性强，不易腐蚀，导热性高，加入的一价金属离子少，电阻率高。特别是作为冻干针剂使用时，制备过程中的温度变化对瓶子的影响不大，有利于保持药物的冻干状态。不宜采用低硼硅玻璃或普通玻璃制作的瓶子作为重组蛋白药物的包装容器。

西林瓶配套的丁基橡胶塞（或丁基胶塞）是现在药用玻璃瓶的主要封口形式，其他材质基本被禁止使用。一般在丁基胶塞表面涂上一层惰性材料来包覆，常用的如聚二甲基硅氧烷膜、聚对二甲苯膜、聚Teflon、ETFE膜、聚酯膜等，具有更好的稳定性和生物相容性。胶塞有平口、单叉、双叉、三叉、四叉等不同样式，平口可用于注射液，其他样式则应用于冻干针剂，便于内外空气传导或充填惰性气体等。

使用前，清洗干净的玻璃瓶往往采用高温干热法灭菌、去热原；胶塞则在碱液除热原后采用湿热高压灭菌。在用于冻干针剂封口时，胶塞必须经过较长时间的60℃干燥以充分去除水分，以免封口后胶塞中的极微量水分透过表面覆膜进入药品中，影响药品的水分含量。注意固定胶塞用的铝盖也需要清洗干净，以免表面的灰尘或金属碎末污染胶塞，对药瓶开启或使用过程产生不利的影响。瓶签上需要标示完整的中英文药品名、剂量、浓度、储藏条件、批号、有效期，以及生产单位等信息。