如何进行细胞培养及蛋白表达优化？

（一）常见细胞

1.原核细胞与真核细胞

（1）原核细胞。

原核细胞指组成原核生物的细胞，其主要特征是细胞内没有以核膜为分界的细胞核，也没有核仁，只有拟核，即在一个无明确分界的低电子密度区内存在不与蛋白质结合的裸露环状DNA分子；细胞质内主要细胞器有70S型核糖体，无线粒体、高尔基体、内质网、中心粒等结构；细胞膜外有细胞壁，部分还有鞭毛结构，细胞膜成分与真核细胞不同。转录和翻译同时进行，四周质膜内含有呼吸酶。

一般用于重组蛋白表达的原核细胞主要为大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌）和枯草芽孢杆菌，也有人采用乳酸菌（Lactobacillus）作为宿主细胞构建重组工程细胞表达目的蛋白，但很少用作蛋白药物制备工艺并开展临床研究的项目。

（2）真核细胞。

真核细胞是指含有真细胞核（核膜包围的核）的细胞，为组成真核生物的基本结构。在其细胞核中，DNA与组蛋白等共同组成染色体结构，核内可看到核仁。细胞质内膜系统很发达，主要存在内质网、高尔基体、线粒体、溶酶体和中心粒等细胞器，分别行使特定的生物学功能。细胞膜为以磷脂双分子层为骨架，内、外或其间镶嵌着具有各种生物学功能的蛋白质分子，共同实现细胞内、外物质和信息交换功能。绝大部分真核生物通过细胞有丝分裂进行有性繁殖。

用于重组蛋白表达的真核细胞主要有酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞。其中，哺乳动物细胞表达系统是现代重组蛋白药物制备的主流技术方向。

2.哺乳动物细胞的有关概念

（1）原代细胞（primary culture cell）。

原代细胞是指从机体取出细胞、组织或器官后，立即开始体外培养的细胞。也有人将体外培养的前10代细胞称为原代细胞。直接取出的细胞经过简单的分离即可以开展体外培养；而组织或器官则必须首先经过机械剪切，然后采用胰蛋白酶等消化、分散，使组织或器官中的细胞游离成单个的细胞，再进行培养。不同来源的原代细胞生长速度与培养难度不同，但都不能在体外长期传代培养。

原代细胞广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究，也应用于药理毒理研究、精准诊疗等生物医药产业领域。

（2）传代细胞与细胞系（cell line）。

传代细胞指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞，一般指来源于分离的肿瘤细胞或细胞传代过程中出现变异的细胞，这些细胞可以在体外持续传代培养，也有人称之为永生化细胞（immortalized cell）。细胞系是指可以在体外稳定传代的某一类细胞的群体，也可以称为传代细胞系。细胞系是重组蛋白表达的重要工具，也广泛应用于生物医学研究与生物医药产业的很多领域。

根据可传代培养的时间，细胞系可以分为有限细胞系（finite cell line）与无限细胞系（infinite cell line）。有限细胞系一般可以在体外持续传代40～50代，如二倍体细胞（diploid cell）；无限细胞系可以在体外无限繁殖传代培养，也称连续细胞系，这类细胞大多已发生异倍化，是已经发生转化的细胞系，进行异体接种时可能具有致瘤性。

由某一细胞系分离出来，并在性状上与原细胞系有差异的细胞系，称亚系（sub line）。

（3）细胞株（cell strain）。

在细胞生物学发展过程中，细胞株与细胞系的概念曾经一度混用。现在（具体指2013年之后），绝大多数行业内研究者基本认同以下观点：细胞系泛指一般的传代细胞；从原代培养物或经生物学鉴定的细胞系中，采用单细胞分离培养或通过筛选后增殖的方法（或称为克隆），获得具有特殊性质或标志的单一培养物，称为细胞株。细胞株的特殊性质或标志在整个培养期间必须始终存在，当描述一个细胞株时，必须说明它的特殊性质或标志。

与细胞系类似，根据传代代数，细胞株可分为有限细胞株（finite cell strain）和连续细胞株（continuous cell strain）。由原细胞株进一步分离培养的与原细胞株性状不同的细胞群，可称为亚株（sub strain）。

（4）细胞系的形成。

除血液细胞外，绝大多数正常的哺乳动物细胞均具有以下性质：①锚地依赖性（anchorage dependence，或称为贴壁依赖性）：细胞必须附着在固体上或固定的表面才能生长、分裂、增殖。②血清依赖性（serum dependence）：细胞必须摄入生长因子才能生长。③接触抑制性（contact inhibition）：细胞与细胞接触后，其生长会受到抑制。④形态依赖性（morphological dependence）：机体内的细胞大多呈扁平状或星形，并有长纤维网状结构。当细胞在体外培养时，这些条件会发生改变，导致细胞不能正常生长和增殖。

在原代细胞进行体外培养过程中，在人为干预下，细胞越过了生理临界点，出现了诸如染色体断裂变成异倍体等情况，失去正常细胞的特点，继续生长并获得无限增殖的能力，称为细胞转化，或细胞系形成。

通过改造细胞特性，如延长细胞周期、缩短细胞倍增时间、降低细胞对培养条件的要求、提高细胞遗传稳定性、添加合适的遗传标记、降低不安全成分的分泌等，以扩大细胞培养规模，提高工程细胞表达水平，实现药物产量的提高。

（5）细胞系的管理。

对于原代细胞，需要选择供体均一，取材部位与组织种类等条件稳定的组织或细胞，并对相关信息予以记录。

对于传代细胞，必须详细记录以下信息：①组织来源：包括细胞供体所属物种（如人体或者动物），个体性别、年龄，取材的器官或组织（如肿瘤组织及其临床诊断、病理特征等），已传代数。②细胞生物学性质：细胞的一般和特殊生物学性状，如一般形态、特异结构、核型、生长曲线、分裂指数、倍增时间、冻融后存活率、接种率等。③培养条件和方法：细胞系（或细胞株）适应的生存环境，如培养基、血清种类及其用量、冻存液、适宜的pH等。④其他信息：如无污染检测、物种检测、免疫检测，以及细胞建立者、检测者等。

世界上一些生物医药发达国家均设立了专门的细胞管理机构，各种传代细胞系或细胞株有特定的编号代码，并纳入专门的细胞库进行规范管理。美国设立了美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），是世界最大的细胞库，也是美国国立卫生研究院（National Institute of Health，NIH）和美国国家癌症研究所（National Cancer Institute，NCI）的资源库，还是世界卫生组织（World Health Organization，WHO）的国际培养细胞文献中心。ATCC接纳来自全球已经检定的细胞系，并向世界各国的科研人员或实验室免费提供研究用细胞。

中国也有专门的中国典型培养物保藏中心（China Center for Type Culture Collection，CCTCC），设在武汉大学内，是1985年国家知识产权局指定，经教育部批准建立的专利微生物保藏机构，受理国内外用于专利程序的微生物保藏。CCTCC保藏细菌、放线菌、酵母菌、真菌、单细胞藻类、人和动物细胞系、转基因细胞、杂交瘤、原生动物、地衣、植物组织、植物种子、动植物病毒、噬菌体、质粒和基因文库等各类微生物（生物材料/菌种）。该中心下设专门的动物细胞库，负责各类动物细胞的鉴定、储藏、培养等，还可以为研究者提供传代历史、生物特性清晰的细胞系（细胞株）。

（二）原核细胞培养与表达

1.大肠杆菌培养与表达基本情况　原核细胞表达系统是应用很广泛，相对最成熟，也是相对最简单的蛋白表达系统，其中大肠杆菌表达系统使用最多、最常见。主要适合于表达非糖基化蛋白质和（或）二级结构比较简单的蛋白质。

将构建好的重组工程菌经过培养，并在一定条件下进行诱导，即可表达目的蛋白。

2.大肠杆菌的培养方法与技术

（1）大肠杆菌常用培养基。

在实验室里，大肠杆菌通常采用试管（culture tube）、摇瓶（flask）振荡培养和发酵罐（fermenter，或称为原核细胞生物反应器）培养。在一定条件下，利用微生物将原料（培养基）经过其特定的代谢途径转化为人类所需要的产物，这个过程常称为发酵。哺乳动物细胞培养过程一般不称为发酵。

大肠杆菌常用LB（lysogeny broth）液体培养基培养。LB培养基主要分为高盐和低盐两种。高盐LB培养基配方为10 g/L胰蛋白胨（tryptone）、5 g/L酵母提取物（yeast extract）和10 g/L氯化钠（NaCl）；低盐LB培养基配方为10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和5 g/L氯化钠。这两种配方培养基都采用氢氧化钠（NaOH）调节pH到7.4，两种培养基的培养效果无明显差别，可在实验中根据不同的大肠杆菌的实际培养情况来选择。配制好LB培养基后，一般倒入三角瓶中，用海绵塞或棉塞封口，再覆以锡箔纸或牛皮纸用棉绳缠紧，在1 Bar（约为15 psi）高压下，或者121℃下，蒸汽灭菌20～30 min。接种大肠杆菌前，在培养基温度不高于40℃时，加入经过滤除菌的适量抗生素。

在进行大肠杆菌菌落观察或进行短暂时间（1～3天）保种时，也可以采用LB培养基进行接种。即在LB液体培养基中加入15～20 g的琼脂粉（agar），经高压灭菌后，将培养基置于洁净工作台中，待培养基降温到40℃左右时，迅速加入过滤除菌的适量抗生素，并立即将培养基倒入培养皿中铺板。

（2）大肠杆菌的保存。

重组大肠杆菌通常采用固体培养基平板划线、半固体培养基穿刺、甘油培养基或真空冻干等四种方法保存。

固体培养基保存：用上述方式配制LB固体培养基，将重组大肠杆菌在LB液体培养基中振荡培养至对数生长期（于紫外-可见分光光度计600 nm波长下检测吸光度A600为0.6～1.0），在洁净工作台中，用无菌接种针蘸取适量细菌悬液在固体培养基表面划线（图2-9），这样可以将细菌稀释到合适浓度，便于单菌落的出现。然后盖上平皿上盖，颠倒平皿，使培养基朝上，置于37℃恒温培养箱中静置培养12～24 h。当固体培养基表面出现直径约1 mm灰白色半透明的单菌落时，可以将培养皿用牛皮纸包裹或装入密封塑料袋，置于2～8℃冰箱中，一般可保存1～3天。

半固体培养基保存：在LB液体培养基中加入7～10 g/L琼脂粉，高压灭菌后，在洁净工作台中，适当温度下加入适量抗生素。混匀后吸取1.2～1.5 mL培养基，加入经过高压灭菌的1.5 mL的EP管或2.0 mL的细胞冻存管中。用高压灭菌的牙签或其他细杆状物体，蘸满处于对数生长期的细菌悬液，插入EP管内的半固体培养基中1～1.5 cm深（图2-10），然后取出。盖好EP管盖，用封口膜缠绕封口，置于37℃恒温培养箱中培养18～36 h，看到培养基中出现一条类似羽毛状的白色菌群，即可转入2～8℃冰箱中，一般可保存1～2个月。

甘油培养基保存：称取若干质量的甘油，经高压灭菌后，按照15%～40%的比例加入在LB液体培养基中培养至对数生长期的重组大肠杆菌悬液中，然后混匀。在洁净工作台中，吸取1.2～1.5 mL混匀后的菌液，加入经过高压灭菌的1.5 mL的EP管或2.0 mL的细胞冻存管中，用封口膜封口。置于-30～-20℃冰箱中冻存，一般可保存1～2年，可作为主种子批和工作种子批的保存方式。

真空冻干保存：将脱脂奶粉用纯净水配制10%的牛奶作为冻干保护剂，采用巴斯德间歇灭菌法灭菌。待牛奶降温到室温后，按照1∶1的比例加入对数生长期的细菌悬液中，混匀。吸取混匀后的菌液到灭菌后的专用菌种玻璃冻存管（图2-3）中，约占冻存管球体一半体积（图2-11），置于-50℃冷冻过夜。然后，移至冷冻干燥机中冷冻干燥12～24 h。将冻存管口接上真空抽气机，当真空度低于0.1 Pa时，在喷气火焰灯下热熔封口，采用激光顶空法或高压放电法检测真空度合格后，置于2～8℃冰箱中，一般可保存5～10年，可作为原始种子和主种子批的保存方式。也可在牛奶中加入适量蔗糖和（或）明胶，用作冻干保护剂。还可采用西林瓶代替专用菌种玻璃冻存管，菌液高度不要超过5 mm。

图2-9　固体培养基上划线接种细菌示意图

图2-10　半固体培养基中穿刺接种细菌示意图

图2-11　细菌菌种冷冻干燥冻存管装量示意图

（3）大肠杆菌的培养与生长曲线检测。

在实验室条件下，重组大肠杆菌一般首先要进行菌种活化处理，即在洁净工作台中，从上述所列各类保存菌种中蘸取少量菌液，加入无菌LB液体培养基中，然后置于37℃恒温摇床上，在180～220 r/min转速下振荡培养过夜。

采用试管培养，培养基高度不要超过试管高度的1/3，试管最好倾斜一定角度放置；采用三角瓶培养，培养基高度不要超过三角瓶梯形部分的1/3。

吸取活化后的细菌，按照1‰～5%的稀释浓度接种到新鲜培养基中，接种后混匀细菌悬液并等体积分装至8～12个相同的试管或三角瓶，在37℃恒温摇床中以180～220 r/min的转速振荡培养。在细菌培养期间，每隔1h取1支试管或三角瓶，将其中的细菌悬液取出在紫外-可见分光光度计下检测吸光度A600。同时从管（瓶）中取1.5 mL混匀悬液加入EP管中，离心去上清液，以新鲜培养基洗涤后再度离心去上清液，开盖置于60℃恒温干燥箱中；3h以后开始每隔1h称量1次细菌质量，待前后两次称量值基本不变，即为该培养时间的细菌干重。将各不同时间的吸光度A600对时间绘制曲线，即为细菌生长曲线。细菌死亡后易降解破碎，离心时绝大部分与上清液一起被弃去，故细菌干重对时间曲线可被看作活菌变化曲线。微生物学中常用的细菌镜检计数法、平板菌落计数法、滤膜检测法等不常用于重组大肠杆菌的一般培养过程。

根据细菌生长曲线，可以对细菌培养温度和振荡频率进行调整，以优化细菌培养工艺流程。当摇瓶培养工艺基本确定，可放大到发酵罐中培养。刚转移至发酵罐中培养时，仅按照摇瓶工艺参数进行培养，不宜立即调整工艺参数。

按照一定的稀释倍数，将细菌悬液接种于发酵罐。大部分发酵罐培养基起始体积为罐体容积的25%～30%，培养基一般可在发酵罐中加温高压灭菌。在细菌培养过程中，可以每1h利用取样针取出细菌悬液检测吸光度A600或细菌干重。在发酵罐培养过程中，可以对细菌培养的温度、搅拌速度、pH、溶氧量，甚至在生化分析仪配套使用下，对细菌生长所需要的C、N、P等元素成分进行补充。一般补液后总体积不得超过发酵罐容积的70%。

细菌培养常用设备的规模和性质如表2-3所示。

表2-3　大肠杆菌摇瓶培养与发酵罐培养的对比(www.xing528.com)

3.重组大肠杆菌表达目的蛋白

（1）重组蛋白表达方式。

利用重组大肠杆菌表达目的蛋白一般有4种方式：胞内包涵体表达，胞内可溶性表达，胞内融合表达与胞外分泌表达。为提高蛋白质表达稳定性、生物活性，或便于后续分离纯化，常采用融合蛋白表达方式。各类表达方式的性质如表2-4所示。

表2-4　原核细胞表达方式对比

胞内包涵体表达：目的蛋白编码结构基因直接位于表达启动子与起始密码子ATG之后，自诱导启动表达开始，由于表达过程中出现的错配、聚集而形成包涵体，包涵体中的蛋白质因未能有效折叠成天然的三级、四级结构，因此不具备蛋白质的生物活性。

胞内可溶性表达：通过诱导条件的调整、优化，可以使目的蛋白不形成或少形成包涵体，目的蛋白在细胞内正常折叠形成天然空间结构，因此具备生物活性。但蛋白质易被酶降解，影响蛋白质表达水平和生物活性。

胞内融合表达：在目的蛋白编码结构基因的上游或下游连接某种原核结构基因，可以表达成融合蛋白。一般融合蛋白具有表达效率高、结构稳定、易鉴别、保持目的蛋白生物活性、易于后续分离纯化等优点。常用的融合蛋白表达体系有谷胱甘肽S转移酶（GST）、6-组氨酸（6-His）等。采用酶切方法可将融合蛋白中的目的蛋白分离出来。

胞外分泌表达：将目的蛋白编码结构基因连接到编码原核蛋白的信号肽序列下游，诱导表达后，信号肽和目的蛋白组成的融合蛋白跨过细胞内膜或外膜后，信号肽被酶切除，目的蛋白被分泌到细胞周质空间或细胞外的培养基中。分泌的表达蛋白通常具有生物活性。

一般情况下，胞内包涵体表达量最高，胞外分泌表达量最低。

（2）重组蛋白的诱导表达。

采用IPTG诱导剂可以与Lac乳糖启动子结合，解除后者对转录的负调控作用，从而启动目的基因的表达。鉴于目的蛋白基因、载体、宿主细胞的不同，具体的诱导剂浓度及诱导时间不同，会出现前述各类不同表达方式。通常较低温度、较低诱导剂浓度，蛋白表达速度较慢，易出现胞内可溶性目的蛋白表达；反之，则蛋白表达快，易出现胞内包涵体表达。也有实验室采用一些特殊的结构基因，与目的蛋白组成融合蛋白，按照自己的意图选择合适的表达方式。

IPTG是一种人工合成的半乳糖苷，具有极强的诱导表达能力，而且不被酶分解，是重组蛋白表达研究中最常用的诱导剂之一。然而，鉴于IPTG是人工合成物质，尚不了解其可能对人体产生的潜在危害，也不清楚其最低安全浓度。因此，在重组蛋白药物生产中，最好采用乳糖作为诱导剂，其安全性可以得到保障。但乳糖可能会被重组细菌作为营养物质吸收代谢，也可能被酶解，所以，需要研究乳糖利用情况，建立稳定的蛋白表达工艺。

采用低浓度磷酸盐培养基诱导表达时，工程菌仍在生长，需要磷来合成细胞壁，过低的磷含量会导致其细胞壁不能正常形成。在随后的分离纯化中，细菌可能聚集成团块，难以与上清液分离或不能有效破碎。因此，诱导表达与分离纯化的条件需要精细探索。采用高温诱导表达时，要注意温度可能对工程菌生长和表达的目的蛋白稳定性的影响。

（三）酵母细胞培养与表达

用于重组蛋白药物表达的常见酵母表达系统有酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）、汉逊酵母（Hansenula polymorpha）、博伊丁假丝酵母（Candida boidinii）和巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）等，后三者属于甲醇酵母（methylotrophy yeast），是可以利用甲醇作为单一碳源来生长的酵母属。目前，药物开发使用较多的有巴斯德毕赤酵母、汉逊酵母和酿酒酵母。

以巴斯德毕赤酵母为例，整个培养诱导表达过程如下：将目的蛋白基因按照酵母偏好密码子进行优化，构建到具有自身信号肽的酵母染色体上；经酵母细胞大量培养，采用甲醇进行诱导，胞外分泌表达前蛋白质常被糖基化，主要是高甘露糖型的糖基化形式表达后可进行信号肽加工。酵母表达系统与原核细胞表达系统相比，具有表达量高、稳定性好、胞外分泌表达和翻译后修饰等优点。

表达载体均为穿梭质粒，可以选择胞内表达载体，如pPICZA、pPIC3.5K等，也可以选择胞外分泌载体，如pPICZαA、pPIC9K等。这些表达载体上都带有甲醇代谢关键酶——醇氧化酶基因-1（alcohol oxidase 1，AOX1）的启动子（pAOX1）和转录终止子（3'AOX 1），外源目的基因一般构建到启动子pAOX1下游。各类载体可以以游离的方式在细胞内进行自我复制，也能以整合型方式存在于细胞中。所谓整合型表达载体，是通过限制性内切酶将载体线性化，采用电穿孔方式转染进入宿主细胞，可以单一交叉或双重交叉同源重组的方式整合到宿主细胞基因组的AOX1基因位置，参与酵母细胞的生长增殖过程。在采用电穿孔方式转染前，将酵母细胞置于1 mol/L冰冷山梨醇中处理成感受态细胞。

源于三磷酸甘油醛脱氢酶启动子（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter，pGAP）的巴斯德毕赤酵母表达载体系统可以利用葡萄糖、甘油、油酸和甲醇等多种试剂作为唯一碳源。研究表明，甲醇作为唯一碳源时，外源目的蛋白表达量最低。一般摇瓶培养水平采用葡萄糖，而在高密度发酵水平采用甘油作为唯一碳源。采用pAO815、pPIC3.5、pPIC9等载体，可以使多个拷贝外源目的基因整合到宿主细胞的染色体，形成多表达单元，可形成高产菌株。

巴斯德毕赤酵母表达系统常用GS115、KM71、PMAD11、PMAD16和MC100-3等宿主菌。将目的基因整合到宿主细胞形成酵母工程细胞后，因染色体的多拷贝表达单元，必须采用大量培养基筛选（筛选范围甚至需要达到千株单菌落培养表达规模），以获得高产且稳定表达的生产用菌种，切不可采取原核细胞工程菌的方式，简单挑选单菌落即罢手。

酵母细胞常用培养基有LB培养基、YPD（yeast extract peptone dextrose，或称YEPD）培养基、BMGY/BMMY培养基、MGY/MM培养基、BMG/BMM培养基、RD/RDH培养基、MD/MDH培养基和SOC培养基。

酵母工程细胞培养周期长，尤其在发酵罐中进行高密度发酵时，常常需要加入纯氧以保障细胞的需氧量。酵母细胞培养过程中会产生大量的热量，因此要注意控制好温度。在环境温度超过25℃时，发酵罐冷却循环水需要采用冰水。注意冰水循环过程中，进入控制器的水管接头处会形成冷凝水，从而影响控制器的正常读数。

在酵母工程细胞发酵培养到合适的密度时，以甲醇作为唯一碳源进行诱导表达。

（四）昆虫细胞培养与表达

昆虫细胞表达系统（insect cell expression system，ICES）也称为杆状病毒表达载体系统（baculovirus expression vector system，BEVS）或杆状病毒-昆虫细胞表达系统。将外源目的基因cDNA重组到杆状病毒基因组载体（bacmid）多角体蛋白启动子下游，替代非必需的野生型多角体基因。重组病毒载体可借助转染试剂转染昆虫细胞或通过基因枪方式感染昆虫幼虫（毛虫），多角体蛋白启动子可以转录极高水平的外源基因表达。杆状病毒-昆虫细胞表达系统是一般实验室中常用的真核表达系统，它具有真核表达系统的翻译后加工功能，如二硫键的形成、糖基化及磷酸化等，重组蛋白在结构和功能上十分接近天然蛋白。其最高表达量可达到昆虫细胞蛋白总量的50%，还可以表达非常大的外源基因（≥200 kD）；具有在同一个昆虫细胞内同时表达多个外源基因的能力。但目前还没有采用该系统表达的人用重组蛋白药物上市。

常用的杆状病毒包括苜蓿银纹夜蛾（核壳体）核型多角体病毒（Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrosis virus，AcMNPV）和家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrosis virus，BmNPV）；常用的宿主细胞有草地贪夜蛾（也称秋行军虫，Spodoptera frugiperda）Sf9细胞、Sf21细胞和粉纹夜蛾（也称甘蓝银纹夜蛾，Cabbage looper）Hi-5细胞（或写作Hi-five，High Five），这些细胞一般半贴壁培养，也可以悬浮培养；常用的细胞培养基有Grace's Antheraea培养基、SF-900 SFM系列培养基和一些专用培养基。

杆状病毒-昆虫细胞表达系统的主要优点：①表达目的蛋白具有完整的生物学功能，如正确的蛋白折叠、二硫键搭配；②蛋白翻译后的加工修饰，接近天然蛋白结构；③表达水平高，可达到蛋白总量的50%；④可容纳大分子（≥200 kD）的插入片段；⑤能同时表达多个基因。

主要缺点：外源蛋白表达处于极晚期病毒启动子的调控下，由于病毒感染时间较长，细胞已经开始死亡。

家蚕生物反应器：将特定的重组昆虫杆状病毒植入家蚕的蚕蛹体内，蚕蛹可以表达目的蛋白。例如，将人胶原蛋白的基因植入家蚕的细胞内，可培育出绢丝腺分泌人胶原蛋白的转基因蚕。将重组人白介素-12（hIL-12）基因的杆状病毒注射入银纹夜蛾幼虫体内，一周后，银纹夜蛾体内血淋巴中即可分泌表达hIL-12。

（五）哺乳动物细胞培养与表达

哺乳动物细胞表达系统是目前重组蛋白药物研发和生产中采用最多的一种方式。

用于重组蛋白表达的哺乳动物细胞要求必须是可以在体外稳定传代培养的细胞株，根据细胞株对体外生长支持条件的要求，这些细胞株通常分为贴壁依赖性细胞（anchorage dependent cell，后文简称贴壁细胞）、非贴壁依赖性细胞（anchorage independent cell，后文简称悬浮细胞）和兼性贴壁细胞（anchorage compatible cell，后文简称半贴壁细胞）三种类型。

大多数动物细胞，如成纤维细胞、上皮细胞、神经细胞等都需要在一定的支持表面生长；来源于血液、淋巴或肿瘤组织的细胞可以不需要固体支持物而在培养液中悬浮生长；来源于动物生殖系统或泌尿组织的大多数细胞既可以贴壁生长，也可以在培养液中悬浮生长。

1.细胞培养的一般要求　动物细胞在体外主要生长在培养液（培养基）中，其中主要考虑的因素有营养物质、培养温度、pH、渗透压、通氧量以及无污染环境。基础培养基的主要成分为氨基酸、维生素、碳水化合物和无机离子，在不同细胞培养中，往往会添加动物血清、激素和细胞因子等营养物质，在实际生产中，无血清、无蛋白培养基已成为标准条件。培养温度通常为哺乳动物的正常体温37℃，或者略低，超过37℃可能会引起细胞的损伤乃至死亡。合适的pH为7.2～7.4，过低或过高的pH会对细胞生长不利。大多数细胞渗透压在260～320 mOsm/L范围。静置培养的细胞一般置于CO2细胞培养箱中，通过5%的CO2环境维持细胞的正常耗氧，而生物反应器中的细胞因密度很大，需要另外给予一定的空气补氧。细胞必须在无污染的环境中生长，外源微生物将会直接影响细胞的生长过程，实验室采用培养液除菌过滤及添加抗生素来抵抗外源微生物的感染；生物反应器则采取高温灭菌培养液以及半透膜正压环境维持无污染环境。需要特别指出的是，细胞污染支原体后，会影响细胞的生长过程和生物学性状，但不会导致细胞的直接快速死亡，因此支原体感染是细胞培养过程中的一个关键问题，后续章节中将具体介绍支原体的检测方法。

与微生物细胞相比，哺乳动物细胞个体大，无细胞壁，抗剪切力强度低，对环境适应能力差。另外，细胞生长相对缓慢，生长周期长，对培养条件要求高，对污染的抵抗能力弱。因此，在培养过程中需要比微生物细胞更加严格的环境条件和营养条件，培养成本比较高。

2.细胞培养过程　关于原代细胞的制备，传代细胞的克隆、冻存和复苏的原理与技术方法，本书不详细介绍，但就用于重组蛋白表达的哺乳动物细胞培养的全过程予以描述。

将工作种子库中冻存的细胞株取出，快速在37℃水浴中融化，经离心、洗涤后，更换无血清培养基。药品研发实验室阶段，主要使用RPMI1640（Roswell Park Memorial Institute 1640）、DMEM（Dulbecco's modified Eagle's medium）、MEM（minimum Eagle's medium）等常用培养基。将细胞转入细胞培养皿或培养瓶中，置于37℃的CO2培养箱中培养。待细胞增殖到一定密度，集中多个细胞培养瓶细胞进行离心洗涤。如果是悬浮培养细胞，可直接转入生物反应器培养。如果是贴壁培养细胞，则需要将细胞重新用培养基悬浮后，转入铺设有足够数量微载体的生物反应器中；采用低速间歇搅拌转动的方式，让贴壁细胞逐步黏附到微载体上并形成单层细胞；逐渐延长搅拌时间和提升转速，使贴壁细胞的微载体始终处于搅拌悬浮状态。

3.目的蛋白表达　如前文“基因表达技术”章节所述，哺乳动物细胞表达目的蛋白一般有诱导表达、瞬时表达和稳定表达等方式。常用的蛋白表达诱导剂有四环素（tetracycline）、蜕皮激素（ecdysterone）、他可莫斯（tacrolimus）、雷帕霉素（sirolimus）和美服培酮（mifepristone，俗称RU486，一种黄体素拮抗剂）等。这些诱导剂在早期研究中较为常用，然而因其潜在的安全性问题，现在哺乳动物细胞表达重组蛋白药物时一般不采用诱导表达方式。瞬时表达是指重组表达载体存在于细胞质内即可以表达目的蛋白，不必进入细胞核并整合到染色体上。其具有简洁、易操作的优点，但存在表达时限短，实现有效表达要求较高的不足，常用于研究、开发阶段，较少用于药品生产过程。稳定表达是指重组表达载体进入细胞核内，并将目的蛋白基因整合到细胞的染色体上，可以随细胞正常的生物学周期稳定表达目的蛋白。其具有稳定、高效、长时间表达的优点，但前期基因插入、整合、筛选操作比较复杂，产品上市后的生产过程通常需要采取这种表达方式。

4.细胞生物反应器　哺乳动物细胞培养与目的蛋白表达的生物反应器种类繁多。根据大小，一般培养体积在5 L以下的采用玻璃罐体，或一次性袋式培养器，或玻璃转瓶；5 L以上的采用不锈钢罐体，最大的生产用生物反应器可达30000 L。罐式生物反应器（后文或简称培养罐）通常设计成夹套式温度控制结构，袋式培养器与玻璃转瓶需要放置在恒温环境中振荡或旋转来控制培养温度。

采用培养罐进行细胞培养时，依据培养液补充方式可分为流加培养与灌流培养两种方式（表2-5）。流加培养也被称为批次培养，即在细胞培养过程中，根据培养液的营养成分、pH等不断补加一些营养物质或酸碱液，最终保证每一罐培养表达含目的蛋白的培养液为一批产品原料。而灌流培养则是在细胞培养表达过程中，不断放出含目的蛋白的培养液，同时不断补充新鲜培养基，使细胞继续培养和表达的方式；可以将多次放出的培养液合并成一批产品原料，也可以采用其中放出的一次或数次培养液作为一批产品或亚批次产品原料。此两种培养方式的差别在于流加培养需要足够大的培养罐，设备制造成本高，但是单一批次产品均一性好，生产周期较短，污染机会减少。灌流培养所需要的培养罐相对较小，制造成本较低，但是多次放出的培养液质量会有一定差异，生产周期长，细胞可能会出现老化，也增加了培养过程受污染的机会。

表2-5　流加培养与灌流培养方式的比较

依据细胞悬浮培养的方式，最常采用的是搅拌式培养罐，或者气升式培养罐。搅拌式培养罐即在细胞罐体中央有一根搅拌轴，轴上有一个或多个搅拌桨叶，通过搅拌轴转动，桨叶搅动培养液，使细胞在培养罐中旋转沉浮。搅拌式培养罐相对而言具有较大的操纵范围，能够提供良好的混合性和浓度平均性，使用更广泛。气升式培养罐是从罐体底部通入气体，使细胞在罐内升腾翻转，可以通过通入气体直接补充细胞培养需要的氧气。其产生的湍动温顺而平均，剪切力相对较小，罐内没有机械部件，细胞操纵性较低。两种方式均可以保证培养液中的营养成分均匀分布，以满足细胞生长的需要。

近年来，随着技术进步和产品的需要，一次性反应袋开始在一些哺乳动物细胞表达重组蛋白药物的生产中使用。即在原有的不锈钢罐外壳内，增加一个高分子材料制作的反应袋，该反应袋与外界可通过过滤装置实现物料进出，通过夹套式接口安装各类指标控制单元以保证正常的培养与表达条件。这种技术的优势在于减少了生产批次间的罐体清洗、零配件更换、培养体系验证等复杂过程，大大缩短了批次之间的间隔时间，提高了系统使用率和可靠性。

5.细胞培养与表达过程中注意的问题　随着大规模哺乳动物细胞培养与重组蛋白表达技术的提高，重组蛋白的表达量从1 g/L提升到接近10 g/L的水平，生产用流加式生物反应器的最大规模已经逐步从10000 L左右下降到2000 L。然而，由于哺乳动物细胞培养需要合适的细胞浓度才能处于一个相对稳定的生长循环状态，因此细胞接种放大的稀释比一般不超过5倍。细胞逐级放大培养的生长周期以及最合适表达细胞浓度的探索是一个关键问题。

在生产环节，细胞培养与蛋白表达原则上不得添加任何血清和动物源蛋白，因此细胞培养基需要进行定制和充分的细胞驯化试验。细胞培养与蛋白表达全程不得添加抗生素，如何保障细胞培养过程不被污染也是一个重要考验。细胞培养过程中，由于培养基中的大量营养物质可能会产生气泡，气泡破裂会损害细胞，选择合适的消泡剂也是需要考虑的因素。

配备自动生化分析仪的生物反应器可以依据其提供的各种检测数据实时自动补充相应的酸、碱、新鲜培养基，以及各类营养补充溶液，相关数据、指标的调控应逐个筛选确定，不要同时改变多个数据，那样会适得其反，事倍功半。

（六）动物生物反应器表达

动物生物反应器是指将外源目的基因以一定方式导入动物细胞的基因组，构建转基因动物，通过动物的某种组织或体液表达目的蛋白，该转基因动物即为动物生物反应器。常见的动物生物反应器有昆虫生物反应器，哺乳动物血液、乳腺、膀胱生物反应器。昆虫生物反应器主要有家蚕生物反应器、银纹夜蛾生物反应器等，即转染基因后，家蚕、银纹夜蛾的淋巴中可以表达目的蛋白。这类生物反应器有关表达方式详见前述杆状病毒-昆虫细胞培养表达部分。哺乳动物血液生物反应器一般将外源目的基因转染到大型家畜的血细胞中，目的蛋白可以通过家畜的血清分离出来，或者分裂血细胞获得血细胞组分中的目的蛋白。哺乳动物膀胱生物反应器指从转基因动物尿液中获得目的蛋白，如将人的生长激素基因转染到小鼠的膀胱上皮细胞中，转基因小鼠可以合成人生长激素并分泌到尿液中。

目前应用最普遍的是哺乳动物乳腺生物反应器（mammary gland bioreactor）。利用乳腺特异性表达的乳蛋白基因调控序列构建含外源目的基因的重组表达载体，通过显微注射方式导入受精卵，发育成转基因动物个体，可以通过转基因动物乳腺特异性、高效率表达外源目的蛋白，并从分泌的乳汁中获得具有活性的目的蛋白。由于乳腺是专门的分泌腺体，乳汁中的目的蛋白易于分离纯化，生产成本低。目前已经有人胰岛素样生长因子（IGF）、人生长激素（hGH）、人促红细胞生成素（EPO）、人凝血因子等重组蛋白在乳腺中成功表达。

常用于制备乳腺生物反应器的动物主要有小鼠、兔、猪、绵羊、山羊和牛等。乳腺组织表达的重组蛋白在结构、功能上与天然蛋白极其相似甚至完全一致，这是其他生物反应器所无法比拟的优点。乳腺生物反应器还具有表达量非常高、生产设备投入低等优点。然而由于转基因效率低和基因随机整合等问题，乳腺生物反应器的常规化、大规模应用一直受到限制。基因编辑等技术的出现，有望在此领域出现突破。

（七）植物生物反应器表达

植物生物反应器即将外源目的基因导入植物细胞，经培育成转基因植物，该转基因植物就是转录表达目的蛋白的植物生物反应器。转基因植物最初的研究主要在于改进植物的性状和品质，以提高植物的经济价值；后来利用转基因植物表达原来植物不具有的新物质，于是大规模培育转基因植物用作植物生物反应器生产人用药物的工作广泛开展起来，目前应用最多的是利用植物生物反应器生产口腔黏膜接种的人用疫苗，以及各类抗体药物。

将外源目的基因构建到大肠杆菌质粒上，重组质粒转染农杆菌，通过同源重组方式整合到农杆菌中的Ti质粒上，通过农杆菌感染植物愈伤组织块，最终外源目的基因整合到植物细胞的基因组中。通过组织培育，植物苗可逐步提高规模培养或种植。也可以将外源目的基因的裸DNA直接导入植物细胞，但是转染效率较低。此外，还有原生质体融合或花粉管通道法转染。

常用作植物生物反应器的植物有烟草、水稻、大豆、玉米、马铃薯、番茄、胡萝卜、苜蓿等植物。目前开发比较成功的产品有转基因烟草生产的用于预防和治疗龋齿的抗sIgA抗体药物、转基因大豆生产的抗人单纯疱疹病毒-2（HSV-2）抗体药物、转基因胡萝卜生产的霍乱毒素β亚单位用作黏膜免疫的霍乱灭活疫苗。2017年，采用转基因水稻表达的人血清白蛋白获得中国药监部门批准，正在开展临床试验。