构建工程细胞：实现细胞定制化

重组蛋白药物从其蛋白获得的过程来看，属于基因工程制药（genetic engineering pharmacy）；如果采用原核细胞或真核生物中的酵母细胞作为宿主进行蛋白的表达，这个技术属于发酵工程；如果采用哺乳动物细胞或其他动、植物细胞培养表达，则可归纳到细胞工程制药范畴；如果制备的重组蛋白是一种酶类物质，又可以划归到酶工程；如果制备的重组蛋白为抗体，可划归为抗体工程，等等。尽管重组蛋白药物有上述不同的分类方式，但其核心都是经过基因重组、工程细胞构建，目标产物的化学本质均为蛋白质，所以都统一称为重组蛋白药物。其基础是基因重组技术，其关键要素是基因、载体与宿主细胞。

（一）工程细胞构建的关键要素

1.基因　基因（gene）是一段可以编码具有生物学功能分子的DNA或RNA序列。在基因表达过程中，DNA首先被转录为RNA（具体为mRNA），mRNA可以直接或作为中间模板翻译成功能大分子——蛋白质。

目的基因有原核基因和真核基因。哺乳动物的基因一般由内含子和外显子间隔组成，其中外显子是功能蛋白的结构基因，是出现在成熟RNA中的序列，也称为表达序列；而内含子是基因中不具有表达功能的部分，一般出现在前体mRNA中，随后在剪接为成熟mRNA过程中被切掉。

2.载体　在细胞生物学中，一组具有共同祖先的同种细胞称为克隆（clone）；在遗传学上，生物的遗传信息与其亲本的遗传信息相同的现象也称为克隆；在分子生物学中，分子克隆指特定分子发生的复制、扩增的过程或方法。

基因必须在一定的宿主细胞内实现表达，其首先必须与某种载体（vector）重组，才能导入宿主细胞，以实现克隆、保存和表达，这种载体是携带外源基因进入宿主细胞的重要工具，一般具有如下特点：①可以在宿主细胞中独立复制，并不影响宿主细胞的正常生理活动；②有一定的选择标记，便于识别和筛选；③可以插入一段相对分子质量较大的外源DNA序列，不影响其自身的复制；④有合适的限制性酶切位点，便于外源基因的插入。

根据上述特点，人们从自然界获得一些天然载体，并采用DNA重组技术予以优化重组，构建了很多具有特定性质的载体。在分子克隆发展过程中，曾出现如质粒（plasmid）、λ噬菌体（λ phage）、丝状噬菌体（filamentous phage）、噬粒（phagemid或phasmid）、黏粒（cosmid）、卡隆粒（charomid）、酵母细胞克隆载体、植物细胞克隆载体和动物细胞克隆载体等多种类型的载体。有些质粒在原核细胞、真核细胞中均可以表达蛋白质，常称为穿梭质粒（shuttle plasmid）。这些载体大小不同，从1～100 kb不等。质粒有严紧型和松弛型两类，严紧型一般只能在细胞内产生几个拷贝，相对分子质量较大，其复制常伴随细胞染色体复制；松弛型可能产生数十个拷贝，其他性质与严紧型相反。载体存在不相容性，同一个宿主细胞内，往往不能有多种载体同时存在，即便有两种以上的载体存在，经过一段时间，其中一种载体必定会竞争获得优势，其他载体逐渐消失。只有不处于同一个不相容组的载体才能共存于一个宿主细胞中。

在基因重组过程中，根据载体的主要作用，常常将载体分为克隆载体（cloning vector）和表达载体（expressing vector）。克隆载体主要用于基因的保存、克隆或构建基因库；表达载体则主要用于在宿主细胞内表达目的蛋白，或构建表达基因库。大部分载体兼具克隆载体与表达载体的双重功能。质粒载体结构如图2-3所示。

图2-3　质粒载体结构图

作为重组蛋白基因表达的载体，一般均具备启动子（promoter）、多克隆位点（multiple clone site，MCS）、抗生素抗性基因、基因表达终止子（terminator）、标记分子，以及其他诸如调控因子、增强子、有助于可溶性表达的结构等。对于原核细胞表达载体，通过改变温度，改变培养基中部分离子浓度，或者给予特殊诱导剂，即可以激活启动子，或解除对启动子的抑制，启动目的蛋白的表达过程。

启动子中使用最广泛的是Lac启动子，它是DNA分子上一段乳糖操纵子（Lac operon）中的核苷酸序列。乳糖操纵子由阻遏蛋白基因（LacI）、启动子、操纵元件（operator）3个基因，以及编码3个与乳糖利用有关的酶的基因（LacZ、LacY、LacA）结构所组成。加入乳糖或其类似物如异丙基硫代半乳糖苷（isopropylthiogalactoside，IPTG），将与阻遏蛋白结合，改变Lac启动子的构型，解除阻遏作用，启动转录（transcription）过程的发生（图2-4）。还有其他常用的启动子，如T7启动子、trp启动子、Tac启动子、IPL启动子等。对于真核细胞，其表达载体上还存在信号肽，用于G418筛选的抗neo基因等结构，可以通过瞬时表达，或者与染色体发生基因转移形成稳定表达的工程细胞。

3.宿主细胞　如前所述，常用的宿主细胞有原核细胞和真核细胞两大类，两类宿主细胞的性质详见表2-1。

表2-1　作为宿主细胞的原核细胞与真核细胞性质对比

图2-4　乳糖操纵子结构以及启动转录示意图

原核细胞一般采用细菌，应用比较普遍的是大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），其中大肠杆菌又是使用最广泛的。大肠杆菌最常用的表达菌株有BL21（DE3）、DH5α、JM109等。原核表达系统具有表达稳定、构建简单、成本低等优点，其最大问题在于外源蛋白转录翻译后缺乏糖基化和磷酸化修饰，而且无法形成复杂二硫键。

真核细胞主要有酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞等。酵母细胞可以进行一定程度的糖基化修饰，但是其糖的类别与哺乳动物细胞有差别。另外在诱导表达过程中，存在表达稳定性的问题。昆虫细胞表达主要与昆虫杆状病毒载体对应，具有表达水平高的优点，然而由于昆虫杆状病毒潜在的安全性问题，目前还没有一种上市产品采用此表达体系。哺乳动物细胞是目前重组蛋白药物生产工艺中的主流表达系统，具有与人体天然蛋白最接近的结构与修饰特点。常用的哺乳动物细胞表达系统有中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cell，CHO细胞）、人胚肾细胞293（human embryo kidney cell 293，HEK293）、乳仓鼠肾细胞（baby hamster kidney cell，BHK细胞）和人纤维肉瘤细胞（HT-1080）等。植物细胞表达时间较短，目前还没有开发用于临床的产品。至于转基因动、植物制备重组蛋白药物的工艺技术，有一些成功的研发成果，或开发成功的药物，鉴于基因定位准确性和表达水平，还不能作为药物制备的主流技术。

（二）表达宿主细胞构建的技术方法

1.目的基因获得

（1）引物合成技术。

引物是指核苷酸聚合作用起始时，可以和核酸模板互补共价结合并发挥复制延伸起点作用的一段单链DNA分子。引物的合成采用固相DNA合成技术，具体技术流程：①将连接在微孔玻璃小球CPG（controlled pore glass）上的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去保护基团DMT（二甲氧基三苯甲基），获得游离的5'-羟基端；②加入亚磷酸酰胺单体与四氮唑活化剂混合物，形成亚磷酸酰胺四唑活性中间体，与反应体系中核苷酸游离的5'-羟基发生缩合反应，核苷酸链延长一个碱基；③加入乙酸酐和甲基咪唑终止后续反应，极少未参与缩合反应的5'-羟基在最后纯化阶段除掉；④加入碘的四氢呋喃溶液使缩合反应中形成的亚磷酸酰胺转化成稳定的磷酸三酯。上述四个步骤完成一个脱氧核苷酸连接到原有的核苷酸链上。重复这个过程可以合成所需要的引物DNA。

（2）基因扩增技术。

基因扩增技术一般均指聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR），DNA在95℃时变性变成单链，60℃左右引物与模板DNA单链按碱基互补配对原则复性结合，72℃左右DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'→3'）的方向延伸合成互补链，在变性、复性、延伸温度之间交替变化，DNA链被不断复制扩增。现在PCR已经发展出巢式PCR（nest PCR）、逆转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）、原位PCR（in situ PCR）、实时定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）、数字PCR等衍生升级技术。还有环介导等温扩增检测（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）等新的DNA扩增技术。

（3）逆转录PCR获得目的蛋白基因。

早期目的基因的获得通常采用逆转录PCR方式获取，即从人或动物体获得组织样本，一般采用专用mRNA提取试剂盒提取组织样本中的信使RNA（message RNA，mRNA），这样其基因序列中不包含真核细胞基因的内含子。然后以mRNA为模板，在适当引物的存在下，由逆转录酶催化合成对应的DNA单链，称为cDNA（complementary DNA），碱处理除去对应RNA后，以单链cDNA为模板，由DNA聚合酶催化合成双链cDNA。在引物设计时，设定适当的酶切位点，以便后续与载体进行重组连接。在进行表达载体构建前，需将cDNA连接构建到克隆载体上，经过扩增，然后进行DNA测序，并根据宿主细胞的简并密码子的偏好，选择更利于表达的密码子替换进行序列优化。

（4）全基因化学合成。

当前，随着人类基因组和其他生物基因测序逐步完成，越来越多的功能基因或结构基因序列明确。基因合成技术不断提高，合成时间缩短，成本下降，在此基础上，只需要按照最优基因序列通过化学合成方式即可获得目的蛋白的全长基因。

化学合成法即将待合成基因设计成若干较短（＜100 bp）的基因片段，片段两侧设计合适的酶切位点；分别采用固相DNA合成技术合成全长引物，利用PCR扩增方法得到各片段双链DNA；再通过DNA连接酶将这些片段分步连接，必要时采用亚克隆方法，最终获得完整的基因序列。每个亚克隆可分别鉴定，因此可减少顺序错误。全基因化学合成是目前获取重组目的蛋白基因准确率最高、速度最快的方法。

（5）基因文库技术。

在分子生物学和遗传学中，基因组（genome）是指一种生物的全部遗传物质，一般指DNA（RNA病毒中指RNA），包括基因、非编码DNA、线粒体和叶绿体中的DNA。

基因文库（gene library）是指某一种生物全部基因的集合。一般分为基因组文库和部分基因文库。基因组文库（genomic library）是将某种生物的全部基因组DNA通过重组连接到某种载体上，并转化受体细胞形成的克隆集合。部分基因文库是指将某种生物的部分基因DNA连接到载体并转化受体细胞形成的克隆集合，如cDNA文库。

根据文库的重组载体功能，其也可分为克隆文库和表达文库。常用的重组载体有质粒、噬菌体、黏粒和细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）等。

基因组文库构建的一般方法是首先提取基因组DNA并片段化，选择合适的载体并大量制备，将DNA片段与载体连接形成重组载体，将重组载体转染宿主细胞。cDNA文库通常首先获得细胞的总RNA，并分离提取mRNA，通过逆转录PCR获得cDNA，然后按照载体连接、转化宿主细胞来构建。DNA重组及其转染细胞技术见后文。

基因文库通常采用核酸杂交法来筛选，即采用一段已知序列的多聚核苷酸通过标记形成探针，在一定条件下，探针通过核苷酸配对杂交，可以与变性后转移到硝酸纤维素膜上的文库DNA序列结合，从而筛选到目的基因序列。对于表达文库，也可以采用抗体探针和免疫印迹方式来结合文库表达的目的蛋白，从而确定目的基因。还可以将噬菌体载体文库在96孔板中稀释，加入适当的PCR缓冲体系，通过PCR扩增文库基因，再采用标记DNA探针结合目的基因，多次重复稀释，最终筛选到目的基因。

2.DNA重组与克隆　分子克隆技术是一组复制DNA分子并构建具有相同DNA分子的细胞群的分子生物学实验方法。包括在体外将目的基因DNA分子片段插入克隆载体上，形成重组克隆载体，将其转化或转染到宿主细胞中，通过细胞的增殖培养，可从细胞中分离获得大量重组克隆载体，实现目的基因DNA分子片段的扩增。分子克隆技术是现代生物学和医学领域的核心技术。

（1）重组表达载体构建。

重组表达载体构建过程如图2-5所示。必要时，选择重组克隆载体上两个合适的酶切位点，与表达载体上的酶切位点相同，且表达方向一致。在限制性内切酶作用下，目的基因DNA与表达载体分别被切成双链线性DNA。然后在DNA连接酶作用下连接成一个闭环双链DNA，称之为重组表达载体。

图2-5　重组表达载体构建示意图

有的限制性内切酶将DNA双链末端切为黏端，即一条链比其互补链长几个核苷酸，目的基因DNA易与载体DNA互补连接；部分酶切末端为平端，即双链一样长，这样不易连接或连接效率略差；尽量选择两端皆切为黏端的限制性内切酶，或至少一端为黏端。酶切位点的选择在重组克隆载体时也需要注意，合成的基因片段两端需要留足够的让限制性内切酶结合的长度。

（2）基因转染技术。

重组载体转入宿主细胞的过程称为转染（transfection）。也有人将重组载体进入宿主细胞的过程根据载体、宿主细胞的不同分别定义为转化（transformation，重组质粒进入原核细胞）、转染（重组质粒进入真核细胞）、转导（transduction，重组病毒载体进入宿主细胞），以及感染（infection，重组病毒载体进入宿主细胞）等各种名词，在生物技术制药语境下，这些名词没有本质上的区别。(www.xing528.com)

转染通常包括非病毒载体转染技术（电穿孔法、基因枪法、磷酸钙DNA共沉淀法、感受态细胞法、脂质体复合物法等）和病毒载体转染技术，这些基因转染技术的主要特点如表2-2所示。

表2-2　基因转染技术的特点

电穿孔（electroporation）法是通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而使DNA透入细胞内，也叫电转染。基因枪（gene gun或biolistic）法一般指采用高压气体将包裹着DNA的球状金粉或钨粉颗粒直接送入细胞或组织，也被称为微粒轰击（particle bombardment）技术。磷酸钙DNA共沉淀（calcium phosphate DNA coprecipitation）法是将DNA与CaCl2混合，然后加入磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，再将含有沉淀的混悬液加到细胞上，通过细胞膜内吞作用摄入DNA。另一种变通方法是将原核细胞（如大肠杆菌）置于0℃低渗CaCl2溶液中，造成细胞膨胀，Ca2+使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离，诱导细胞成为感受态细胞；细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA黏附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基-磷酸钙复合物；将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随机出现许多间隙，外源DNA可能被细胞吸收，这个方法也称为感受态细胞（competent cell）法。脂质体复合物（liposome complex）法也称为脂质体介导（liposome mediated）法，即表面带正电荷的阳离子脂质体可以与带负电荷的DNA通过静电作用形成复合体，被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过融合或细胞内吞作用，偶尔也可通过渗透作用，复合物被传递进入细胞形成包涵体或进入溶酶体，脂质体被溶解，DNA被释放到细胞质，或者进入细胞核。

病毒载体通常由表达质粒和包装质粒组成，表达质粒包含包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，包装质粒提供从转录、包装到重组成假病毒载体所需的所有辅助蛋白。将表达质粒与包装质粒共同转染包装细胞，在细胞中完成病毒的包装，包装好的假病毒分泌到细胞外上清液中，经离心收集病毒颗粒，即可用于对宿主细胞的转染。常用的病毒载体有逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体和单纯疱疹病毒载体等。其中部分载体包装后会裂解包装细胞从而被释放。

宿主细胞被重组载体成功转染成为重组工程细胞。

（3）基因表达技术。

重组工程细胞中的重组载体以两种形式存在（图2-6），一种是以独立的重组载体存在于细胞质中，在细胞分裂增殖中，载体被均匀分配到分裂后的两个细胞，在传代过程中，存在重组载体丢失的可能；另一种是重组载体（至少包括目的基因和标记基因等）整合到宿主细胞的染色体上，在细胞增殖分裂时，目的基因和标记基因随染色体复制而存在于两个子代细胞的染色体上。

图2-6　重组DNA载体转染宿主细胞后的两种存在方式

重组工程细胞可通过重组载体或细胞自身的蛋白表达系统，实现目的基因转录和翻译（translation）过程，表达目的蛋白。

作为原核细胞表达载体的重组大肠杆菌，主要通过培养条件改变诱导蛋白表达，有胞内包涵体（inclusion bodies）表达、胞内可溶性（soluble）表达和胞外分泌（secretion）表达三种形式。酵母细胞主要是诱导分泌表达目的蛋白的方式。哺乳动物细胞一般有诱导表达、瞬时表达和稳定表达等方式，通过重组载体或者细胞染色体中目的基因前端的启动子、增强子、信号肽、核糖体结合位点、转录起始信号、转录终止信号、翻译起始密码子、翻译终止密码子、拼接信号、多聚腺苷酸信号等各类调节基因，以及各类酶基因的共同作用下，实现目的基因的转录、翻译以及修饰等过程，最后在胞内表达并分泌到胞外。为了目的蛋白的稳定或易于后续分离筛选，常常构建融合蛋白基因来表达融合蛋白。作为重组蛋白药物，原则上要求最后将融合蛋白中的目的蛋白分离出来。

（4）遗传稳定性与表达稳定性。

遗传稳定性与表达稳定性常常采用质粒丢失率检测方法来确定。对于重组表达载体独立存在于宿主细胞的情况，通常采用加压方式以保障重组工程细胞中的重组载体稳定存在，即在抗生素存在等条件下，只有保证一定数量重组质粒的工程细胞才能正常生长繁殖，而丢失重组质粒的工程细胞被破坏。但在生产过程中，培养基中一般不能含有抗生素，因此必须选择那些可以在无抗生素条件加压方式下传代足够代次而不丢失重组质粒的工程细胞作为生产的种子保存。例如，一种工程菌在生产过程中需要传代60代，将其在无抗生素条件下培养20～30代，然后将培养液点样到无抗生素固体培养基上培养，共100个点；待其长成合适菌落后，分别接种到含抗生素固体培养基上培养（图2-7），如果有100个菌落长成，称质粒稳定率为100%；重复4～6次，即工程菌在无抗性培养基中传代90～120代，如果质粒稳定率不低于95%，该菌种可以作为生产用种子。否则，必须重新筛选，甚至重新克隆、转染构建新工程细胞。

图2-7　稳定性结果图（50个总菌落，实测应各有2块LB琼脂平板）

质粒稳定率=LB琼脂平板（Amp+）菌落数/LB琼脂平板（Amp-）菌落数

对于重组载体整合到宿主细胞染色体的情况，需要不断提高加压水平，以筛选出整合目的基因最高的工程细胞。如某重组表达载体上的遗传标记基因二氢叶酸还原酶基因（DHFR）具有抵抗甲氨蝶呤（MTX）的作用，当DHFR与目的基因一起被整合到宿主细胞染色体后，该工程细胞具有在含MTX的培养基中生长繁殖的能力；将培养基中MTX浓度从0.05μmol/L逐步提高到5μmol/L，存活下来的工程细胞染色体上的DHFR基因拷贝数将比只能抵抗0.05μmol/LMTX的工程细胞高100倍，即工程细胞染色体上的目的基因拷贝数提高了100倍，大部分拷贝数较低的细胞被破坏。存活下来的工程细胞拥有较高的目的蛋白表达水平，这样保证了生产过程中目的蛋白的表达量，而整合到染色体上的目的基因不容易丢失，在生产过程中不需要给予MTX来保证其遗传稳定性。

3.其他相关技术

（1）基因测序。

基因测序的目的是确定基因中核苷酸的排列顺序。从1975年至今，已经发展了3代测序技术。

第一代测序技术也称为Sanger法测序，在合成反应体系（含聚合酶、引物、待测DNA、4种dNTP）中，分别加入一定比例带标记的双脱氧核苷酸ddNTP（ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP），由于ddNTP两端都不含羟基，在DNA合成中不能形成磷酸二酯键，于是中断合成反应，形成不同长度的带标记的DNA片段，通过凝胶电泳和放射自显影，可根据电泳带的位置确定待测的DNA序列。

第二代测序技术是因应“人类基因组计划”的需要而出现，经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454测序技术，Illumina公司的Solexa测序技术、Hiseq测序技术，ABI公司的Solid测序技术和ThermoFisher公司的IonTorrent技术为代表，核心是用不同颜色的荧光标记4种不同核苷酸碱基，主要通过对碱基出现的先后顺序来进行判断。与第一代测序技术相比，第二代测序成本下降、时间缩短、通量提高、准确性提高，但测序长度较短。

第三代测序技术的发展思路为保持第二代测序技术的速度和通量优势，弥补读长较短的劣势。主要代表技术为Oxford Nanopore公司的纳米孔测序技术、PacBio公司的SMRT技术、Helicos公司的单分子荧光可逆终止技术。与前两代测序技术相比，其最大的特点是单分子测序，不需要进行PCR来扩增DNA片段。

也有人将IonTorrent技术归纳为第三代测序技术，还有人将纳米孔测序技术称为第四代测序技术。

（2）多肽合成技术。

对于相对分子质量较小的多肽药物，一般采用两种方式制备：一种是将多个多肽基因序列串联构建到一个重组载体中，各多肽基因之间设计多肽酶的酶切位点，多个多肽表达后，酶切获得单个多肽；另一种是直接采用化学合成方法获得多肽。化学合成多肽的技术一般指多肽固相合成技术（solid phase peptide synthesis，SPPS），是1963年R.Brace Merrifield设计发明的，称为BOC（叔丁氧羰基）法，其因此获得1984年诺贝尔化学奖。1972年Lou Carpino发明FMOC（9-芴甲氧羰基）法，这种方法比BOC法具有更多优势，现在大多采用此法。

FMOC法以羧基树脂作为固相载体，加入一个氨基被FMOC保护的氨基酸，经N，N'-二环己基碳二亚胺（dicyclohexyl carbodiimide，DCC）或羧基二咪唑的活化，氨基酸与固相载体形成共酯得到固定；然后加入第二个被保护的氨基酸，经活化与第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述肽键形成反应，肽链从C端向N端生长，直至达到所需的肽链长度。最后脱去保护基，用三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）水解肽链和固相载体之间的酯键，得到合成好的多肽。经HPLC等方法分离纯化。

固相合成的优点主要在于最初的反应物和产物都连接在固相载体上，因此，可以在一个反应容器中完成全部反应，便于自动化操作，加入过量反应物可获得高产率的产物，同时产物很容易分离。现在常用多肽自动合成仪来实现多肽合成工作。

（3）转基因技术。

广义的转基因技术（transgenic technology）就是前述基因工程技术、基因重组技术，或遗传工程技术。当前一般将微生物转基因技术称为重组技术，而转基因技术特指动物、植物的基因重组技术。

将目的基因通过重组技术转染动物生殖细胞，如精子、卵细胞或受精卵，再通过生殖技术培育成可以表达目的蛋白或出现新生物性状的转基因动物，称为动物转基因技术。如表达人凝血因子Ⅷ的转基因乳牛、瘦肉型猪等。

将目的基因通过重组技术转染植物细胞，通过组织培育获得可以表达目的蛋白或新生物性状的转基因植物，称为植物转基因技术。如表达人血清白蛋白的水稻、抗病虫害的苏云金杆菌转基因棉花等。

（4）合成生物学技术。

合成生物学（synthetic biology）是一门新兴的生物学和工程学的交叉学科，各不同专业领域科学家对合成生物学的定义有较大差异，现在比较普遍认可的定义是为实用目标而设计和构建生物模块、生物系统、生物机器，或对现有生物系统重新设计的学科。

合成生物学技术是指采用基因工程、分子生物学、系统生物学、膜科学、生物物理学、电子工程、计算机工程、控制工程和进化生物学等理论和技术，有目的地重新设计、改造天然生物的基因、细胞器、细胞，或者设计构建新型人工基因组、人工生物元器件、人工细胞，乃至重新合成生命体的技术。合成生物学技术将广泛应用于生物制造、生物医药、农业、资源环境等领域。

（5）蛋白质工程。

蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律、生物功能，以及两者关系为基础，通过化学、物理和分子生物学的技术方法进行基因合成或修饰，改造现有蛋白质或制造一种新的蛋白质的技术。广义概念中，蛋白质工程就是基因工程；狭义概念中，基因工程更强调前面的基因重组过程，蛋白质工程的重点是对现有蛋白质基因的改造并表达出来的过程。

4.种子批（细胞库）管理　重组工程细胞构建完成，并经过遗传稳定性、表达稳定性检查等过程，初步确定该细胞株具有产业化开发的价值后，应立即着手建立重组工程细胞的种子批系统（seed lot system，细胞库系统），以保证后续生产过程与产品质量的一致性。种子批（细胞库）通常包括原始种子（original seed，细胞种子）、主种子批（master seed lot，主细胞库）和工作种子批（working seed lot，工作细胞库）三级。

原始种子指经适应性培养、传代，对重组工程细胞及其表达目的蛋白的生物学特性、免疫原性和遗传稳定性等性质研究鉴定，可用于生产的种子，原始种子用于主种子批的制备。由原始种子传代扩增至特定代次，并经一次制备获得同质和均一的悬液分装于容器制得主种子批，主种子批用于制备工作种子批。由主种子批传代扩增至特定代次，并经一次制备获得同质和均一的悬液并分装于容器制得工作种子批，工作种子批用于正式产品的生产。种子批扩增如图2-8所示。通常情况下，各级种子批中的任何一支种子使用后，不得返回重新制作本级或上级种子批。理论上，每一种种子批数量将在使用中逐步减少。

图2-8　种子批扩增示意图

在研发过程中，可以只制备二级种子批。待中试放大研究完成，可以取出一支原始种子，按照种子批制备规范完成三级种子批的制备。依据产品特征、制备工艺和市场预计大小，每种种子批的数量可为10～30支不等。