1.标准曲线的绘制
标准样品的HPLC色谱图如图9-36所示。图中可见，五种单糖未达基线分离，由此可知单柱分离时分离难度较大。纯化后降解液的HPLC色谱图如图9-37所示，图中保留时间为12min时出现一小峰，可能为水解物中的杂质峰或者原料未完全水解产生的多糖峰，也有可能是色谱柱中残留的杂质所致。对葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的峰面积和进样浓度进行线性拟合，如表9-15所示。在0～10.0g/L范围内，三种单糖的峰面积与浓度的线性关系良好。
图9-36 标准样品的HPLC色谱图
1—D-葡萄糖；2—D-木糖；3—D-半乳糖；4—L-阿拉伯糖；5—D-果糖
图9-37 糖液各组分HPLC谱图
分析精密度实验中高效液相色谱法测定的数据，如表9-16所示。相对标准偏差值（RSD）值均在1%以内，说明该方法精密度较好。
表9-16 精密度测定结果
2.色谱分离树脂的确定
选取106Ca2+、Dow 99Ca2+、Dowex 50 WX4Ca2+、001×4Ca2+、001×4Na2+五种树脂，分别考察对三种糖分离的影响。实验中选取流速0.4mL/min、温度60℃、上样浓度40%、上样体积5mL，用去离子水作为流动相。在相同条件下进行实验。结果如表9-17所示。
表9-17 不同树脂对分离度的影响
注 a表示葡萄糖与木糖的分离度，b表示木糖与阿拉伯糖的分离度。
由表9-26可知，Dow 99Ca2+树脂对三种糖的分离度最高，其次为Dowex 50 WX4Ca2+树脂，再次是106Ca2+树脂，最后是001×4Ca2+和001×4Na2+树脂。由001×4Ca2+和001×4Na2+树脂对糖液的分离度可看出，钙型树脂更利于木糖与阿拉伯糖两者之间的分离，而钠型树脂则利于木糖与葡萄糖之间的分离。故选取Dow 99Ca2+树脂进行影响因素的分析。
3.洗脱流速对分离度的影响
在温度为60℃，上样浓度35%，上样体积5mL时，改变流动相流速，不同流速下的分离度如图9-38所示。由图可知，葡萄糖—木糖的分离度和木糖—阿拉伯糖的分离度均随流速的增加而降低，低流速下分离效果较好。故选取流速为0.4mL/min为宜。
4.柱温对分离度的影响
在上样浓度35%，流速0.4mL/min，上样体积5mL时，改变单柱温度，测定不同温度下的分离度，结果如图9-39所示。
由图9-39可知，三种糖分的分离度均随温度的升高呈先增大后减小的趋势。木糖—阿拉伯糖的分离度在温度为60℃时最大，葡萄糖—木糖的分离度在温度为50 ℃时达最大值，与60℃时分离度相当。这是由于温度增加，分子运动能量加大，传质速率加大，使得分离度增大。综合考虑，选取柱温60℃。
5.上样浓度对分离度的影响
在流速0.4mL/min，柱温60℃，上样体积5mL时，分别对糖液浓度进行单因素实验，比较分离度的大小。结果如图9-40所示。由图可以看出，随着糖浓度的增加两糖分离的分离度均随浓度的增加呈先增大后减小的趋势。在糖浓度为40%时，葡萄糖—木糖和木糖—阿拉伯糖的分离度均达最大值分别为0.631和0.503，继续增加糖浓度，分离度值减小，增大糖浓度增加了柱的负荷，使分离速率降低。糖浓度较低时，分离度基本不变，分离效果较好，但生产效率低，综合考虑，选取糖浓度为40%为最佳上样浓度。
图9-38 洗脱流速对分离度的影响(www.xing528.com)
图9-39 柱温对分离度的影响
图9-40 上样浓度对分离度的影响
6.上样体积对分离度的影响
在流速0.4mL/min，柱温60℃，进样浓度为40%时，分别上样1mL、3mL、5mL、8mL、10mL，观察上样体积对分离度的影响。结果如图9-41所示。由图可以看出，分离度随进样量的增加而减小。进样量为5mL时，葡萄糖—木糖和木糖—阿拉伯糖的分离度均达最大，随后继续增大进样量，两分离度均呈下降趋势。增大进样量增加了柱子的负荷，分离效果较差。因此选取上样体积为5mL为宜。
图9-41 上样体积对分离度的影响
综合上述单因素实验中最佳条件，在流速0.4mL/min、温度60℃、上样浓度40%、上样体积5mL的操作条件下，对糖液进行柱分离，结果如表9-18所示，糖液的分离曲线如图9-42所示。
表9-18 糖组分分离参数
续表
图9-42 糖液各组分分离曲线图
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