金黄色葡萄球菌（Staphy Lococcus Aureus）为一种革兰氏染色阳性球形细菌。其在显微镜下排列成葡萄串状，无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜，常见于皮肤表面及上呼吸道黏膜，在空气、水、灰尘、人和动物的排泄物中都可找到，故食品受其污染的机会很多。由于其可以产生肠毒素，食用后能引起食物中毒，是常见的引起食物中毒的致病菌，因此检测食品中金黄色葡萄球菌有实际意义。
本检验方法依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》（GB 4789.10—2010），第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验；第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数；第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。
1.原理
食品中金黄色葡萄球菌的测定主要是利用样品的7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤增菌液接种于血平板和Baird-Parker平板，观察菌落形态和产色素情况。挑取金黄色葡萄球菌进行革兰氏染色镜检，观察其形态和染色特性，符合者进一步做血浆凝固酶试验。方法是在新鲜兔血浆中加入BHI培养物，在36℃±1℃条件下培养，每半小时观察一次，观察6h，呈现凝固者为阳性。
2.培养基和试剂
10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤、7.5%氯化钠肉汤、血琼脂平板、Baird-Parker琼脂平板、脑心浸出液肉汤（BHI）、兔血浆、稀释液（磷酸盐缓冲液）、营养琼脂小斜面、革兰氏染色液、无菌生理盐水。
3.设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
1）恒温培养箱：36℃±1℃。
2）冰箱：2～5℃。
3）恒温水浴箱：37～65℃。
4）天平：感量为0.1g。
5）均质器。
6）振荡器。
7）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。
8）无菌锥形瓶：容量为100mL、500mL。
9）无菌培养皿：直径为90mm。
10）注射器：0.5mL。
11）pH计或pH比色管或精密pH试纸。
4.检验方法
（1）金黄色葡萄球菌定性检验（第一法）
1）检验程序：金黄色葡萄球菌定性检验程序如图7-8-8所示。
图7-8-8 金黄色葡萄球菌定性检验程序
2）操作步骤
①检样的处理：称取25g样品加入盛有225mL 7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，以8000～10000r/min的转速均质1～2min，或放入盛有上述液体的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min。若样品为液态，则吸取25mL样品加入盛有225mL 7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶（瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠）中，振荡混匀。
②增菌和分离培养
a.将处理完的样品匀液于36℃±1℃培养18～24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。
b.将增菌后的培养物，分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板，血平板于36℃±1℃培养18～24h，Baird-Parker平板于36℃±1℃培养18～24h或45～48h。
c.金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落，有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡一些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，呈圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。
③鉴定
a.染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽孢，无荚膜，直径为0.5～1μm。
b.血浆凝固酶试验
• 挑取Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5mL BHI和营养琼脂小斜面，于36℃±1℃培养18～24h。
• 取新鲜配制的兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入BHI培养物0.2～0.3mL，振荡摇匀，置于36℃±1℃温箱或水浴箱内，每0.5h观察一次，观察6h，若呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的1/2，则判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。
• 若结果可疑，则挑取营养琼脂小斜面的菌落，放入5mL BHI中，于36℃±1℃培养18～48h，重复试验。
④葡萄球菌肠毒素的检验。可疑食品中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定，应按GB 4789.10—2010的要求进行葡萄球菌肠毒素的测定。
3）金黄色葡萄球菌的报告
①结果判定：若符合上述鉴定结果，则可判定为金黄色葡萄球菌。
②结果报告：在25g（mL）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。
（2）金黄色葡萄球菌Baird-Parker平板计数（第二法）
1）检验程序：金黄色葡萄球菌Baird-Parker平板法检验程序如图7-8-9所示。
图7-8-9 金黄色葡萄球菌Baird-Parker平板法检验程序
2）操作步骤
①样品的稀释
a.固体和半固体样品：称取25g样品放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，以8000～10000 r/min的转速均质1～2min；或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min，制成1∶10的样品匀液。
b.液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1∶10的样品匀液。
c.用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管，反复吹打使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液。
d.按c中的操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。
②样品的接种：根据对样品污染状况的估计，选择2个或3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液，以0.3mL、0.3mL、0.4mL接种量分别加入三块Baird-Parker平板，然后用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，若Baird-Parker平板表面有水珠，则可放在25～50℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。(www.xing528.com)
③培养：在通常情况下，涂布后，将平板静置10min，若样液不易吸收，则可将平板放在培养箱中于36℃±1℃培养1h，等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，于36℃±1℃培养45～48h。
④典型菌落计数和确认
a.金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落，有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡一些，外观可能粗糙并干燥。
b.选择有典型金黄色葡萄球菌菌落，且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在20～200CFU之间的平板，计数典型菌落数。
• 如果只有一个稀释度平板的菌落数在20～200CFU之间且有典型菌落，则计数该稀释度平板上的典型菌落。
• 若最低稀释度平板的菌落数小于20CFU且有典型菌落，则计数该稀释度平板上的典型菌落。
• 若某一稀释度平板的菌落数大于200CFU且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，则应计数该稀释度平板上的典型菌落。
• 若某一稀释度平板的菌落数大于200CFU且有典型菌落，且下一稀释度平板上有典型菌落，但其平板上的菌落数不在20～200CFU之间，则应计数该稀释度平板上的典型菌落。
以上按式（7-8-3）计算。
• 若两个连续稀释度的平板菌落数均在20～200CFU之间，则按式（7-8-4）计算。
• 从典型菌落中任选5个菌落（小于5个的全选），分别按血浆凝固酶试验做血浆凝固酶试验。
3）结果计算与报告
①结果计算
T=AB/Cd （7-8-3）
式中 T——样品中金黄色葡萄球菌菌落数；
A——某一稀释度典型菌落的总数；
B——某一稀释度血浆凝固酶阳性的菌落数；
C——某一稀释度用于血浆凝固酶试验的菌落数；
d——稀释因子。
T=（A1B1/C1+A2B2/C2）/1.1d （7-8-4）
式中 T——样品中金黄色葡萄球菌菌落数；
A1——第一稀释度（低稀释倍数）典型菌落的总数；
A2——第二稀释度（高稀释倍数）典型菌落的总数；
B1——第一稀释度（低稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数；
B2——第二稀释度（高稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数；
C1——第一稀释度（低稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的菌落数；
C2——第二稀释度（高稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的菌落数；
1.1——计算系数；
d——稀释因子（第一稀释度）。
②结果报告：根据Baird-Parker平板上金黄色葡萄球菌的典型菌落数，按式（7-8-3）和式（7-8-4）计算，报告1g（mL）样品中金黄色葡萄球菌数，以CFU/g（mL）表示；若T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。
（3）金黄色葡萄球菌MPN计数（第三法）
1）检验程序：金黄色葡萄球菌MPN法检验程序如图7-8-10所示。
2）操作步骤
①样品的稀释：与第二法的稀释方法相同。
图7-8-10 金黄色葡萄球菌MPN法检验程序
②接种和培养
a.根据对样品污染状况的估计，选择3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液接种到10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤管，每个稀释度接种3管。将上述接种物于36℃±1℃培养45～48h。
b.用接种环从有细菌生长的各管中移取1环，分别接种Baird-Parker平板，于36℃±1℃培养45～48h。
③典型菌落的确认
a.金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落，有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡一些，外观可能粗糙并干燥。
b.从典型菌落中至少挑取1个菌落接种到BHI肉汤和营养琼脂斜面，于36℃±1℃培养18～24h，进行血浆凝固酶试验，参见第一法。
3）结果与报告
计算血浆凝固酶试验阳性菌落对应的管数，查MPN检索表（见附录B），报告1g（mL）样品中金黄色葡萄球菌的最可能数，以MPN/g（mL）表示。
5.注意事项
1）样品采集后，应尽快进行检验，并将待检样品在低温和通风良好的条件下储藏，以防肠毒素形成。
2）在Baird-Parker平板上典型菌落特征为：圆形，光滑突起，湿润，直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘常为淡色（米黄色或灰白色略带灰色），周围为一混浊带，在其外缘常有一透明圈。用接种针接触菌落，似有黄油树胶的黏稠感。偶尔会遇到不分解脂肪的菌株，除无混浊带及透明圈外，其他外观基本相同。
3）从长期保存的冷冻或干燥食品中所分离出的菌落，其黑色常较典型菌落淡一些，且外观可能粗糙，质地较干燥。
4）将金黄色葡萄球菌接种到兔血浆上后，每0.5h观察一次，当怀疑有凝固现象时，将血浆轻轻倾斜或慢慢倒置，若流动，则证明没有凝固。
5）增菌培养基一般用7.5%氯化钠肉汤，由于葡萄球菌有耐受高盐的特性，因此能在此菌液中生长。除某些嗜高盐的海洋菌以外，大多数细菌都被增菌液中的高盐所抑制。
免责声明：以上内容源自网络，版权归原作者所有，如有侵犯您的原创版权请告知，我们将尽快删除相关内容。
