食品安全：沙门氏菌检验简介

沙门氏菌属（Salmonella）是一群寄生于人类和动物肠道内，生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌。有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有的对人和动物都致病，这些统称为沙门氏菌。沙门氏菌污染食品主要有两种途径：一为内源性污染；二为外源性污染。食品在加工、运输、出售过程中往往被沙门氏菌污染。感染沙门氏菌或食用被带菌者粪便污染的食品，可使人食物中毒。引起食物中毒最多的沙门氏菌有：鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌。它们主要污染鱼肉、禽蛋和乳品等食物，在食品中繁殖并释放毒素。因此，对食品加强沙门氏菌的检验，在食品卫生学上具有重要的意义。

在此依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》（GB 4789.4—2010），介绍适用于食品中沙门氏菌检验的方法。

1.原理

食品中沙门氏菌的检验主要包括5个基本步骤：

1）前增菌，用无选择性培养基使处于濒死状态的沙门氏菌恢复活力。

2）选择性增菌，使沙门氏菌得以增殖，而使大多数的其他细菌受到抑制。

3）选择性平板分离沙门氏菌。

4）生化试验，鉴定到亚属。

5）血清学分型鉴定。

2.培养基和试剂

缓冲蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、亚硫酸铋（BS）琼脂、HE琼脂、木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂、沙门氏菌属显色培养基、三糖铁（TSI）琼脂、蛋白胨水和靛基质试剂、尿素琼脂（pH=7.2）、氰化钾（KCN）培养基、赖氨酸脱羧酶试验培养基、糖发酵管、邻硝基酚β-D半乳糖苷（ONPG）培养基、半固体琼脂、丙二酸钠培养基、沙门氏菌O和H诊断血清、生化鉴定试剂盒。

3.设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

1）恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃。

2）冰箱：2～5℃。

3）均质器。

4）电子天平：感量为0.1g。

5）振荡器。

6）无菌锥形瓶：容量为250mL、500mL。

7）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。

8）无菌培养皿：直径为90mm。

9）无菌试管：3mm×50mm、10mm×75mm。

10）无菌毛细管。

11）pH计或pH比色管或精密pH试纸。

12）全自动微生物生化鉴定系统。

4.检验程序

沙门氏菌检验程序如图7-8-6所示。

图7-8-6 沙门氏菌检验程序

5.操作步骤

（1）前增菌 称取25g（mL）样品放入盛有225mL BPW的无菌均质杯中，以8000～10000r/min的转速均质1～2min；或置于盛有225mL BPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍1～2min。若样品为液态，则不需要均质，振荡混匀。若需测定pH值，则用1mol/mL无菌NaOH或HCl调pH值至6.8±0.2。无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中，若使用均质袋，则可直接于36℃±1℃培养8～18h。

（2）增菌和分离培养

1）轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于10mL TTB内，于42℃±1℃培养18～24h；另取1mL，转种于10mL SC内，于36℃±1℃培养18～24h。

2）分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）上，于36℃±1℃分别培养18～24h（XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板）或40～48h（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落。沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表7-8-3。

表7-8-3 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征

（3）生化试验

1）自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上的典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺。接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±1℃培养18～24h，必要时可延长至48h。沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果见表7-8-4。

表7-8-4 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果

注：K表示产碱；A表示产酸；+表示阳性；-表示阴性；+（-）表示多数阳性，少数阴性；+/-表示阳性或阴性。

2）在接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水（用于靛基质试验）、尿素琼脂（pH=7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种，于36℃±1℃培养18～24h，必要时可延长至48h，按表7-8-5判定结果。将已挑菌落的平板储存于2～5℃或室温，至少保留24h，以备必要时复查。

表7-8-5 沙门氏菌属生化反应初步鉴别

注：+表示阳性；-表示阴性；+/-表示阳性或阴性

①反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。若尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常，则按表7-8-6可判定为沙门氏菌；若有2项异常，则判定为非沙门氏菌。

表7-8-6 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

注：+表示阳性；-表示阴性。

②反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。(www.xing528.com)

③反应序号A3：补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。

④必要时按表7-8-7进行沙门氏菌生化群的鉴别。

表7-8-7 沙门氏菌属各生化群的鉴别

注：+表示阳性；-表示阴性。

3）若选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，则可根据“1）”初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。

（4）血清学鉴定

1）抗原的准备：一般采用1.2%～1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。当O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高（2%～3%）的培养基上再检查；如果由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应，则可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。当H抗原发育不良时，将菌株接种在0.55%～0.65%半固体琼脂平板的中央，待菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.3%～0.4%半固体琼脂的小玻璃管1次或2次，自远端取菌培养后再检查。

2）多价菌体抗原（O）的鉴定：在玻璃片上划出2个约1cm×2cm的区域，挑取1环待测菌，各放1/2环于玻璃片上每一个区域的上部，在其中一个区域下部加1滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照，再用无菌的接种环或接种针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻璃片倾斜摇动混合1min，并对着黑背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。

3）多价鞭毛抗原（H）的鉴定同多价菌体抗原（O）的鉴定。

4）血清学分型（选做项目）

①O抗原的鉴定：用A～F多价O血清做玻璃片凝集试验，同时用生理盐水作对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。

对于被A～F多价O血清凝集者，依次用O4、O3、O10、O7、O8、O9、O2和O11因子血清做凝集试验，根据试验结果，判定O群。对于被O3、O10血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19单因子血清做凝集试验，判定E1、E2、E3、E4各亚群，每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果，没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。

对于不被A～F多价O血清凝集者，先用9种多价O血清检查，若有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的O群血清逐一检查，以确定O群。每种多价O血清所包括的O因子如下：

O多价1 A、B、C、D、E、F群（并包括6，14群）

O多价2 13、16、17、18、21群

O多价3 28、30、35、38、39群

O多价4 40、41、42、43群

O多价5 44、45、47、48群

O多价6 50、51、52、53群

O多价7 55、56、57、58群

O多价8 59、60、61、62群

O多价9 63、65、66、67群

②H抗原的鉴定：属于A～F各O群的常见菌型，依次用表7-8-8中的H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。

表7-8-8 A～F群常见菌型H抗原表

对于不常见的菌型，先用8种多价H血清检查，若其中有一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种血清所包括的各种H因子血清逐一检查第1项和第2项的H抗原。8种多价H血清所包括的因子如下：

H多价1 a，b，c，d，i

H多价2 eh，enx，enz₁₅，fg，gms，gpu，gp，gq，mt，gz₅₁

H多价3 k，r，y，z，z₁₀，lv，lw，lz₁₃，lz₂₈，lz₄₀

H多价4 1，2；1，5；1，6；1，7；z₆

H多价5 z₄z₂₃，z₄z₂₄，z₄z₃₂，z₂₉，z₃₅，z₃₆，z₃₈

H多价6 z₃₉，z₄₁，z₄₂，z₄₄

H多价7 z₅₂，z₅₃，z₅₄，z₅₅

H多价8 z₅₆，z₅₇，z₆₀，z₆₁，z₆₂

每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果，没有H单因子血清的要用两个H复合因子血清进行核对。

检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原的或检出第2相H抗原而未检出第1相H抗原的，可在琼脂斜面上移种1代或2代后再检查。若仍只检出一个相的H抗原，则要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必做位相变异检查。位相变异试验方法如下：

a.小玻璃管法：将半固体管（每管1～2mL）在酒精灯上熔化并冷至50℃，取已知相的H因子血清0.05～0.1mL，加入已熔化的半固体内，混匀后，用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻璃管内，待凝固后，用接种针挑取待检菌，接种于一端。将小玻璃管平放在平皿内，并在其旁放一团湿棉花，以防琼脂中水分蒸发而干缩。每天检查结果，待另一相细菌解离后，可以从另一端挑取细菌进行检查。培养基内血清应有适当的比例，过高时细菌不能生长，过低时同一相细菌的动力不能抑制，一般按原血清1∶200～1∶800的量加入。

b.小倒管法：将两端开口的小玻璃管（下端开口要留一个缺口，不要平齐）放在半固体管内，小玻璃管的上端应高出培养基的表面，灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热熔化，冷至50℃，挑取因子血清1环，加入小套管中的半固体内，略加搅动，使其混匀，待凝固后，将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可从套管外的半固体表面取菌检查，或转种1%软琼脂斜面，于37℃培养后再做凝集试验。

c.简易平板法：将0.35%～0.4%半固体琼脂平板表面的水分烘干，挑取因子血清1环，滴在半固体平板表面，放置片刻，在血清吸收到琼脂内后，在血清部位的中央点种待检菌株，培养后，在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。

③Vi抗原的鉴定：用Vi因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌。

④菌型的判定：根据血清学分型鉴定的结果，按照有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。

6.沙门氏菌的报告

综合生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g（mL）样品中检出或未检出沙门氏菌。

7.注意事项

1）在前增菌时，若为冷冻产品，则应在45℃以下不超过15min，或2～5℃不超过18h解冻后再进行。对于未经过加工的生食品或污染严重的食品，直接选用选择性增菌。

2）在测定过程中要注意关掉无菌风，进行无菌操作，同时注意戴口罩、手套等防护品。

3）做完试验后要养成善后的好习惯，手部、操作台、试验废弃物要进行消毒处理。