乳酸菌检验方法及其在发酵食品中的重要性

乳酸菌（Lactic Acid Bacteria）是一类可发酵糖，主要产生大量乳酸的细菌的通称。乳酸菌需氧或兼性厌氧，多数无动力，过氧化氢酶阴性，革兰氏阳性，无芽孢杆菌或球菌。

乳酸菌在发酵食品中的应用非常广泛。它对人体健康有益，但需要达到一定的数量，才有可能到达并定植在人体肠道内，抑制有害菌的增殖和活动，维持肠道的微生态平衡。所以作为含活性乳酸菌的食品，应突出乳酸菌并保持一定的活菌数。由于产品中活乳酸菌的数量直接影响产品质量，因此乳酸菌计数已成为评价该类产品能否合格的重要指标。

在此依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》（GB 4789.35—2010），介绍适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验方法。其中所指乳酸菌主要为乳杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和链球菌属（Streptococcus）。

1.原理

乳酸菌菌落总数的测定主要是指检样通过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）进行涂布、培养后，所得1g或1mL检样中形成的乳酸菌菌落总数。

2.培养基

MRS（Man Rogosa Sharpe）培养基及莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）改良MRS培养基、MC（Modified Chalmers）培养基、0.5%蔗糖发酵管、0.5%纤维二糖发酵管、0.5%麦芽糖发酵管、0.5%甘露醇发酵管、0.5%水杨苷发酵管、0.5%山梨醇发酵管、0.5%乳糖发酵管、七叶苷发酵管、革兰氏染色液、莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）（化学纯）。

3.设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

1）恒温培养箱：36℃±1℃。

2）冰箱：2～5℃。

3）均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。

4）天平：感量为0.1g。

5）无菌试管：18mm×180mm、15mm×100mm。

6）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。

7）无菌锥形瓶：容量为250mL、500mL。

4.检验程序

乳酸菌检验程序如图7-8-5所示。

图7-8-5 乳酸菌检验程序

5.操作步骤

（1）样品的制备

1）冷冻样品：可先使其在2～5℃条件下解冻，时间不超过18h，也可在温度不超过45℃的条件下解冻，时间不超过15min。

2）固体和半固体食品：以无菌操作称取25g样品，置于装有225mL生理盐水的无菌均质杯内，以8000～10000r/min的转速均质1～2min，制成1∶10样品匀液；或置于225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min，制成1∶10的样品匀液。

3）液体样品：先将其充分摇匀，再以无菌吸管吸取样品25mL，放入装有225mL生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成1∶10的样品匀液。

（2）制备10倍系列稀释液

1）用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中（吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌吸管，反复吹打使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液。

2）另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，制作10倍递增样品匀液。每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。

（3）乳酸菌总数 根据待检样品活菌总数的估计，选择2个或3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1mL样品匀液分别置于2个MRS琼脂平板上，使用L形棒进行表面涂布，于36℃±1℃厌氧培养48h±2h后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板涂布要求在15min内完成。

（4）双歧杆菌计数 根据对待检样品双歧杆菌活菌总数的估计，选择2个或3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1mL样品匀液置于莫匹罗星锂盐改良MRS琼脂平板上，使用灭菌L形棒进行表面涂布，每个稀释度做两个平板，于36℃±1℃厌氧培养48h±2h后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板涂布要求在15min内完成。

（5）嗜热链球菌计数 根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计，选择2个或3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1mL样品匀液分别置于2个MC琼脂平板上，使用L形棒进行表面涂布，于36℃±1℃需氧培养48h±2h后计数。嗜热链球菌在MC琼脂平板上的菌落特征为：菌落中等偏小，边缘整齐光滑的红色菌落，直径为2mm±1mm，菌落背面为粉红色。从样品稀释到平板涂布要求在15min内完成。

（6）乳杆菌计数

用乳酸菌总数减去双歧杆菌与嗜热链球菌计数之和即得乳杆菌计数。

（7）菌落计数

1）可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位CFU表示。

2）选取菌落数在30～300CFU之间，无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为“多不可计”。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

3）其中一个平板有较大片状菌落生长时，不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的1/2，而其余1/2中菌落分布又很均匀，则可计算半个平板的菌落数后乘以2，代表一个平板菌落数。(www.xing528.com)

4）当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，将每条单链作为一个菌落计数。

6.结果的表述

1）若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，则计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应的稀释倍数，作为每克或每毫升检样中的菌落总数结果。

2）若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内，则按式（7-8-2）计算。

N=∑C/（n₁+0.1n₂）d （7-8-2）

式中 N——样品中菌落数；

C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；

n₁——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；

n₂——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；

d——稀释因子（第一稀释度）。

3）若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为“多不可计”，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

4）若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

5）若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。

6）若所有稀释度的平板菌落数均不在30～300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

7.菌落数的报告

1）当菌落数小于100CFU时，按四舍五入原则修约，以整数报告。

2）当菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用四舍五入原则修约后，取前两位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按四舍五入原则修约后，采用两位有效数字。

3）称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。

8.乳酸菌的鉴定（可选做）

（1）纯培养 挑取3个或以上单个菌落，嗜热链球菌接种于MC琼脂平板，乳杆菌属接种于MRS琼脂平板，于36℃±1℃厌氧培养48h。

（2）鉴定

1）双歧杆菌的鉴定按GB 4789.34—2012的规定操作。

2）涂片镜检：乳杆菌属的菌体形态多样，呈长杆状、弯曲杆状或短杆状，无芽孢，革兰氏染色阳性；嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状，直径为0.5～2.0μm，成对或成链排列，无芽孢，革兰氏染色阳性。

3）乳酸菌菌种主要生化反应见表7-8-1和表7-8-2。

表7-8-1 常见乳杆菌属的碳水化合物反应

（续）

注：+表示90%以上的菌株阳性；-表示90%以上的菌株阴性；d表示11%～89%的菌株阳性；ND表示未测定。

表7-8-2 嗜热链球菌的主要生化反应

注：+表示90%以上的菌株阳性；-表示90%以上的菌株阴性。

9.注意事项

1）倾倒培养基时要适量，一般在15～20mL之间，避免因涂布平板的培养基不够而影响乳酸菌的培养。

2）制备10系列稀释液时，要将不同倍数的稀释液振荡均匀，以免影响测定结果。

3）每递增稀释一次，必须另换1支1mL灭菌吸管，这样所得检样的稀释倍数才准确。