大肠菌群计数：食品卫生常规检查

大肠菌群是根据卫生学方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌。这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化试验，可将这群细菌再分为埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属等。

检查大肠菌群数，一方面能表明食品中有无粪便污染，另一方面还可以根据其数量，判定食品受污染的程度，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。该菌主要来源于粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。

在此依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》（GB 4789.3—2010），介绍适用于食品中大肠菌群计数的方法。

1.原理

大肠菌群是指在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。食品中大肠菌群的计数方法主要有MPN法和平板计数法。MPN法是基于泊松分布的一种间接计数法，以每克或每毫升检样内大肠菌群最近似数（Most Probable Number，MPN）表示。平板计数法是指食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，挑取不同类型的典型和可疑菌落，移种于BGLB肉汤管内培养，对所得每克或每毫升检样中形成的大肠菌群计数。

2.培养基和试剂

1）月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤。

2）煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤。

3）结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）。

4）磷酸盐缓冲液。

5）无菌生理盐水。

6）无菌1mol/L的NaOH。

7）无菌1mol/L的HCl。

3.设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

1）恒温培养箱：36℃±1℃。

2）冰箱：2～5℃。

3）恒温水浴箱：46℃±1℃。

4）天平：感量为0.1g。

5）均质器。

6）振荡器。

7）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。

8）无菌锥形瓶：容量为500mL。

9）无菌平皿：直径为90mm。

10）pH计或pH比色管或精密pH试纸。

11）菌落计数器。

4.计数方法

（1）大肠菌群MPN计数法（第一法）

1）检验程序：大肠菌群MPN计数法的检验程序如图7-8-2所示。

2）操作步骤

①检样的稀释(www.xing528.com)

a.固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，以8000～10000r/min的转速均质1～2min，或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min，制成1∶10的样品匀液。

图7-8-2 大肠菌群MPN计数法的检验程序

b.液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品，加入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1∶10的样品匀液。

c.样品匀液的pH值应控制在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl进行调节。

d.用1mL无菌吸管吸取1∶10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入盛有9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液。

e.根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管。

②初发酵试验

每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL，于36℃±1℃条件下培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生。若产气，则需要进行复发酵试验；若未产气，则继续培养至48h±2h。产气者进行复发酵试验，未产气者为大肠菌群阴性。

③复发酵试验

用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，于36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性。

3）大肠菌群最可能数（MPN）的报告：按复发酵试验确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录A），报告每克或每毫升样品中大肠菌群的MPN值。

（2）大肠菌群平板计数法（第二法）

1）检验程序：大肠菌群平板计数法的检验程序如图7-8-3所示。

图7-8-3 大肠菌群平板计数法的检验程序

2）操作步骤

①样品的稀释按MPN计数法进行。

②平板计数

a.选取2个或3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。

b.及时将15～20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3～4mLVRBA覆盖平板表层，翻转平板，置于36℃±1℃培养18～24h。

c.平板菌落数的选择：选取菌落数在15～150CFU之间的平板，分别对平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落进行计数。典型的菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。

③证实试验：从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，于36℃±1℃培养24～48h，观察产气情况。只要BGLB肉汤管产气，就可报告为大肠菌群阳性。

3）大肠菌群平板计数的报告：经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以“平板菌落数的选择”中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克或每毫升样品中的大肠菌群数。例如：1mL 10^-4样品稀释液，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中的10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为100×6/10×10⁴/g（mL）=6.0×10⁵CFU/g（mL）。

5.注意事项

1）初发酵试验时，每管接种量为1mL，若超过1mL，则要用双料LST肉汤。

2）在初发酵试验过程中，有时可以看到在发酵管内存有极微小的气泡（有时比小米粒还小）。一般来说，产气量与大肠菌群检出率呈正相关，但因样品种类不同而不同，有小于米粒的气泡也可有阳性检出。有时也可遇到在初发酵时产酸无气，但复发酵却证实为大肠菌群阳性情形。倒管内虽无气体，但在液面及管壁上却可以看到缓缓上浮的小气泡。所以，若对未产气的LST肉汤发酵管有疑问，则可以用手轻轻打动试管，当有气泡沿管壁上浮时，即应考虑可能有气体产生，而应做进一步观察。

3）最可能数（MPN）是表示对样品中活菌密度的估测。MPN检索表采用三个稀释度[0.1g（mL）、0.01g（mL）和0.001g（mL）]，每个稀释度接种3管（即九管法）。稀释度的选择基于对样品中菌数的估测。较理想的结果应是最低稀释度3管为阳性，而最高稀释度3管为阴性。如果无法估测样品中的菌数，则应做一定范围的稀释度。MPN检索表列出了95%可信限供参考。

4）LST、BGLB等培养基在灭菌时，小导管中有时出现气泡排不尽的现象。其主要原因：一是分装LST、BGLB时，小导管中有水柱；二是高压灭菌时，需急排气，而灭菌后又迅速冷却。

5）观察气泡时，要对光倾斜试管，使小导管紧贴在试管壁上，便于观察。