孔雀石绿和结晶紫具有高毒素、高残留，以及致癌致畸、致突变等特点，其进入生物体内后，就会产生具有更强危害的隐性孔雀石绿和隐性结晶紫。鉴于孔雀石绿和结晶紫的危害性，包括我国在内的许多国家都将它们列为水产养殖中的禁用药物。但由于孔雀石绿和结晶紫具有较好的杀菌作用，且具有高效、价廉、易得等优点，一些养殖渔民在防治水霉病等病害时使用孔雀石绿、结晶紫，个别运输商用孔雀石绿、结晶紫对运输水体消毒，以延长鱼类在长途贩运中的存活时间。
近年来，随着人们对孔雀石绿和结晶紫安全性的关注，其检测方法的研究也受到很大的重视，关于孔雀石绿和结晶紫的检测方法的报道很多。国家标准《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》（GB/T 19857—2005）采用液相色谱-串联质谱和高效液相色谱法，《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 高效液相色谱荧光检测法》（GB/T 20361—2006）采用的是高效液相色谱荧光检测法。
1.高效液相色谱荧光检测法
（1）原理 样品中残留的孔雀石绿或结晶紫用硼氢化钾还原为其相应的代谢产物隐色孔雀石绿或隐色结晶紫，然后用乙腈-乙酸铵缓冲混合液提取，用二氯甲烷液萃取，用固相萃取柱净化，用反相色谱柱分离，用荧光检测器检测，用外标法定量。
（2）试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，试验用水应符合GB/T 6682—2008一级水的标准。
1）常用试剂：乙腈（色谱纯）、二氯甲烷、酸性氧化铝（分析纯，粒度为0.071～0.150mm）、二甘醇、硼氢化钾、无水乙酸铵、冰乙酸、氨水。
2）硼氢化钾溶液（0.03mol/L）：称取0.405g硼氢化钾置于烧杯中，加250mL水溶解，现用现配。
3）硼氢化钾溶液（0.2mol/L）：称取0.54g硼氢化钾置于烧杯中，加50mL水溶解，现用现配。
4）20%盐酸羟胺溶液：将12.5g盐酸羟胺溶解在50mL水中。
5）对甲苯磺酸溶液（0.05mol/L）：称取0.95g对甲苯磺酸，用水溶解并稀释至100mL。
6）乙酸铵缓冲溶液（0.1mol/L）：称取7.71g无水乙酸铵溶解于1000mL水中，用氨水调pH值至10.0。
7）乙酸铵缓冲溶液（0.125mol/L）：称取9.64g无水乙酸铵溶解于1000mL水中，用冰乙酸调pH值至4.5。
8）酸性氧化铝固相萃取柱：500mg，3mL，使用前用5mL乙腈活化。
9）Varian PRS柱或相当者：500mg，3mL，使用前用5mL乙腈活化。
10）标准品：孔雀石绿、结晶紫，纯度均大于98%。
11）标准储备溶液：准确称取适量的孔雀石绿、结晶紫标准品，用乙腈分别配制成100μg/mL的标准储备液。
12）混合标准中间液（1μg/mL）：分别准确吸取1.00mL孔雀石绿和结晶紫的标准储备溶液，置于100mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成1μg/mL的混合标准中间液，于-18℃避光保存。
13）混合标准工作溶液：根据需要，临用时准确吸取一定量的混合标准中间液，加入0.03mol/L的硼氢化钾溶液0.4mL，用乙腈准确稀释至2.00mL，配制成适当浓度的混合标准工作溶液。
（3）仪器 高效液相色谱仪（配荧光检测器）、匀浆机、离心机（转速为4000r/min）、旋涡振荡器、固相萃取装置、旋转蒸发仪。
（4）取样 鱼去鳞、去皮，沿背脊取肌肉部分；虾去头、壳、肠腺，取肌肉部分；蟹、甲鱼等取可食部分。将样品切为不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块后混合。
（5）提取 称取5.00g样品置于50mL离心管中，加入10mL乙腈，以10000r/min的转速匀浆提取30s，然后加入5g酸性氧化铝，振荡2min，以4000r/min的转速离心10min，将上清液转移至125mL分液漏斗中，在分液漏斗中加入2mL二甘醇和3mL硼氢化钾溶液（0.2mol/L），振摇2min。
另取50mL离心管，加入10mL乙腈，洗涤匀浆机刀头10s，将洗涤液移入前一离心管中，加入3mL硼氢化钾溶液（0.2mol/L），用玻璃棒捣散离心管中的沉淀，并搅匀，在旋涡振荡器上振荡1min，静置20min，以4000r/min的转速离心10min，将上清液并入125mL分液漏斗中。
在50mL离心管中继续加入1.5mL 20%盐酸羟胺溶液、2.5mL对甲苯磺酸溶液（0.05mol/L）、5.0mL乙酸铵缓冲溶液（0.125mol/L，pH=4.5），振荡2min，加入10mL乙腈，继续振荡2min，以4000r/min的转速离心10min，将上清液并入125mL分液漏斗中，重复上述操作一次。
在分液漏斗中加入20mL二氯甲烷，带塞剧烈振荡2min，静置分层，将下层溶液转移至250mL茄形瓶中，继续向分液漏斗中加入5mL乙腈、10mL二氯甲烷，振荡2min，把全部溶液转移至50mL离心管中，以4000r/min的转速离心10min，将下层溶液合并至250mL茄形瓶中，于45℃旋转蒸发至近干，用2.5mL乙腈溶解残渣。
（6）净化 将PRS柱安装在固相萃取装置上，上端连接酸性氧化铝固相萃取柱，用5mL乙腈活化，转移提取液到柱上，再用乙腈洗茄形瓶两次，每次2.5mL，依次过柱，弃去酸性氧化铝柱，吹PRS柱近干，在不抽真空的情况下，加入3mL等体积混合的乙腈和乙酸铵溶液（0.1mol/L，pH=10.0），收集洗脱液，用乙腈定容至3mL，过0.45μm滤膜，供液相色谱测定用。
（7）高效液相色谱检测样品参考条件
1）ODS-C18柱，柱长度为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm，或相当者。
2）流动相：（80+20）乙腈-乙酸铵溶液（0.125mol/L，pH=4.5）。
3）流速：1.3mL/min。
4）柱温：35℃。
5）激发波长：265nm。
6）发射波长：360nm。
7）进样量：20μL。
（8）色谱分析 向液相色谱仪中分别注入20μL孔雀石绿和结晶紫混合标准工作溶液及样品提取液，按上述色谱条件进行色谱分析，记录峰面积，响应值均应在仪器检测的线性范围内。根据标准品的保留时间定性，用外标法定量。
（9）结果计算 样品中孔雀石绿和结晶紫的残留量按式（7-7-6）计算。
式中 X——样品中待测组分残留量（mg/kg）；
c——待测组分标准工作液的质量浓度（μg/mL）；
A——样品中待测组分的峰面积；
As——待测组分标准工作液的峰面积；
V——样液最终定容体积（mL）；
m——样品质量（g）。(www.xing528.com)
计算结果保留两位有效数字。在重复性条件下获得的两次独立测量结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
（10）试验说明 孔雀石绿和结晶紫混合标准溶液的线性范围为0.1～600ng/mL。
2.高效液相色谱法
（1）原理 试样中的残留物用乙腈-乙酸铵缓冲溶液提取，乙腈再次提取后，液液分配到二氯甲烷层并浓缩，经酸性氧化铝净化后，高效液相色谱-二氧化铅柱后衍生测定，用外标法定量。
（2）试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，试验用水应符合GB/T 6682—2008一级水的标准。
1）常用试剂：乙腈（液相色谱纯）、二氯甲烷、甲醇（液相色谱纯）、二甘醇、酸性氧化铝（80～120目）、二氧化铅、硅藻土545（色谱层析级）。
2）乙酸盐缓冲溶液：将4.95g无水乙酸钠及0.95g对甲苯磺酸溶解于950mL水中，用冰乙酸调节溶液pH值到4.5，最后用水稀释到1L。
3）20%盐酸羟胺溶液：将12.5g盐酸羟胺溶解在50mL水中。
4）1mol/L对甲苯磺酸溶液：称取17.2g对甲苯磺酸，用水溶解并稀释至100mL。
5）50mmol/L乙酸铵缓冲溶液：称取3.85g无水乙酸铵，溶解于1000mL水中，用冰乙酸调pH值至4.5。
6）标准品：孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫，纯度均大于98%。
7）标准溶液：准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫标准品，用乙腈分别配制成100μg/mL的标准储备液，再用乙腈稀释配制成1μg/mL的标准溶液，于-18℃避光保存。
8）混合标准工作溶液：用乙腈稀释标准溶液，配制成每毫升含孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫均为20ng的混合标准溶液，于-18℃避光保存。
（3）仪器
1）常用仪器 高效液相色谱仪（配紫外-可见光检测器）、匀浆机、离心机（转速为4000r/min）、固相萃取装置。
2）25%二氧化铅氧化柱：不锈钢预柱管[5cm×4mm（内径）]，两端附2μm过滤板，在抽真空的条件下，填装含有25%二氧化铅的硅藻土，添加数滴甲醇压实，旋紧，临用时用甲醇冲洗，并将二氧化铅氧化柱连接在紫外-可见光检测器与液相色谱柱之间。
3）酸性氧化铝柱：1g/3mL，使用前用5mL乙腈活化。
（4）提取 称取5.00g样品置于50mL离心管中，加入1.5mL20%盐酸羟胺溶液、2.5mL对甲苯磺酸溶液（1mol/L）、5.0mL乙酸盐缓冲溶液，用匀浆机以10000r/min的转速匀浆提取30s，然后加入10mL乙腈，剧烈振荡30s，加入5g酸性氧化铝，再次振荡30s，以3000r/min的转速离心10min，将上清液转移至装有10mL水和2mL二甘醇的100mL离心管中，然后在50mL离心管中加入10mL乙腈，重复上述操作，合并乙腈层。
（5）净化 在离心管中加入15mL二氯甲烷，振荡10s，以3000r/min的转速离心10min，将二氯甲烷层转移至100mL梨形瓶中，再用5mL乙腈、10mL二氯甲烷重复上述操作一次，将二氯甲烷层合并于100mL梨形瓶中，于45℃旋转蒸发至约1mL，用2.5mL乙腈溶解残渣。
将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上，将梨形瓶中的溶液转移到柱上，再用乙腈洗涤梨形瓶两次，每次2.5mL，依次过柱，控制流速不超过0.6mL/min，收集全部流出液，于45℃旋转蒸发至近干，将残留液准确用0.5mL乙腈溶解，过0.45μm滤膜，供液相色谱测定用。
（6）高效液相色谱检测样品参考条件
1）C18柱，长度为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm，或相当者。在C18色谱柱和检测器之间连接25%二氧化铅氧化柱。
2）流动相：乙腈和乙酸铵缓冲溶液（50mmol/L，pH=4.5），梯度洗脱参数见表7-7-2。
3）流速：1mL/min。
4）柱温：室温。
5）检测波长：618nm（孔雀石绿），588nm（结晶紫）。
6）进样量：50μL。
表7-7-2 流动相梯度洗脱参数
（7）色谱分析 根据样品中被测孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫的含量，选定峰高相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测的线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积进样测定。
（8）空白试验 除不加试样外，均按以上操作步骤进行。
（9）结果计算 按式（7-7-7）计算样品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫残留量，计算结果需扣除空白值。
式中 X——样品中待测组分残留量（mg/kg）；
c——待测组分标准工作液的浓度（μg/mL）；
A——样品中待测组分的峰面积；
As——待测组分标准工作液的峰面积；
V——样液最终定容体积（mL）；
m——最终样液所代表的试样量（g）。
在重复性条件下获得的两次独立测量结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
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