食品中苏丹红的检测方法

苏丹红色素是一种红色或橙红色的工业染料，用于溶剂、油、蜡等产品的增色以及鞋、地板的增光。有关研究表明，苏丹红具有一定的代谢毒性，在人体内还原酶的作用下生成相应的胺类与萘酚等致癌物质，被国际癌症研究机构（IARC）列为第2类或第3类致癌物质。其具有脂溶性，能在人体内积累，尤其是在脂肪组织中容易产生富集。其在代谢过程中产生的苯胺接触人体皮肤或进入消化道后，可以作用于肝细胞，引起中毒性肝病，还可能诱发肝癌，此外，其中间代谢物萘酚也有致癌、致畸、致敏、致突变的潜在毒性，大量吸收可引起出血性肾炎。但是由于苏丹红比食用色素更易着色，价格相对低廉，不少食品生产经营单位和个体生产者为美化食品的外观，无视有关法规，将其充当食用色素滥用，以谋求更大利益，对人类健康造成了极大的危害。因此，做好苏丹红检测方法的研究具有一定的现实意义。

目前，苏丹红的检测方法有薄层色谱法、免疫学检测方法、在线分子印迹-化学发光法、高效液相色谱法、液质联用法等。国家标准《食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法》（GB/T 19681—2005）采用的是高效液相色谱法。

1.原理

样品经溶剂提取、固相萃取净化后，用反相高效液相色谱-紫外可见光检测器进行色谱分析，采用外标法定量。

2.试剂与仪器

（1）试剂

1）常用试剂：乙腈（色谱纯）、丙酮（色谱纯、分析纯）、甲酸（分析纯）、乙醚（分析纯）、正己烷（分析纯）、无水硫酸钠（分析纯）。

2）层析用氧化铝（中性，100～200目）：于105℃干燥2h，在干燥器中冷至室温，每100g中加入2mL水降活，混匀后密封，放置12h后使用。

3）5%丙酮的正己烷液：吸取50mL丙酮，用正己烷定容至1L。

4）标准物质：苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ，纯度均大于或等于95%。

5）标准储备液：分别称取苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ各10.0mg（按实际含量折算），用乙醚溶解，然后用正己烷定容至250mL。

（2）仪器

1）高效液相色谱仪，配有紫外检测器或二极管阵列检测器。

2）层析柱管：1cm（内径）×5cm（高）的注射器管。

3）氧化铝层析柱：在层析柱管底部塞入一薄层脱脂棉，以干法装入处理过的氧化铝至3cm高，轻敲实后加一薄层脱脂棉，用10mL正己烷淋洗，洗净柱中杂质后，备用。

4）其他仪器：分析天平（感量为0.1mg）、旋转蒸发仪、均质机、离心机、0.45μm有机滤膜。

3.样品的制备

将液体、浆状样品混合均匀，固体样品需磨细。

4.样品的处理

（1）红辣椒粉等粉状样品 称取1～5g（准确至0.001g）样品置于锥形瓶中，加入10～30mL正己烷，超声5min，过滤，用10mL正己烷洗涤残渣数次，至洗出液无色，合并正己烷液，用旋转蒸发仪浓缩至5mL以下，慢慢加入氧化铝层析柱中。为保证层析效果，在柱中保持正己烷液面为2mm左右时上样，在全程的层析过程中不应使柱干涸。用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶，一并注入层析柱。控制氧化铝表面吸附的色素带宽，宜小于0.5cm。待样液完全流出后，视样品中含油类杂质的多少，用10～30mL正己烷洗柱，直至流出液无色，弃去全部正己烷淋洗液，用60mL含5%丙酮的正己烷液洗脱，收集、浓缩后，用丙酮转移并定容至5mL，用0.45μm有机滤膜过滤后待测。

（2）红辣椒油、火锅料、奶油等油状样品 称取0.5～2g（准确至0.001g）样品置于小烧杯中，加入适量的正己烷（1～10mL）溶解，难溶解的样品可在正己烷中加热溶解，以下按（1）中“慢慢加入氧化铝层析柱……过滤后待测”操作。(www.xing528.com)

（3）辣椒酱、番茄沙司等含水量较大的样品 称取10～20g（准确至0.01g）样品置于离心管中，加10～20mL水（含增稠剂的样品多加水）将其分散成糊状，加入30mL（3+1）正己烷-丙酮混合液，匀浆5min，以3000r/min的转速离心10min，然后吸出正己烷，向下层再加入正己烷匀浆（共两次，每次20mL），离心，合并3次正己烷，加入无水硫酸钠5g脱水，过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持5min，用5mL正己烷溶解残渣后，按（1）中“慢慢加入氧化铝层析柱……过滤后待测”操作。

（4）香肠等肉制品 称取10～20g（准确至0.01g）粉碎样品置于锥形瓶中，加入60mL正己烷充分匀浆5min，滤出清液，再以正己烷匀浆（共两次，每次20mL），过滤，合并3次滤液，加入5g无水硫酸钠脱水，过滤后于旋转蒸发仪上蒸至5mL，以下按（1）中“慢慢加入氧化铝层析柱……过滤后待测”操作。

5.高效液相色谱检测样品参考条件

1）C₁₈柱，长度为150mm，内径为4.6mm，粒度为3.5μm，或相当者。

2）流动相：溶剂A为（85+15）0.1%甲酸的水溶液-乙腈；溶剂B为（80+20）0.1%甲酸的乙腈溶液-丙酮。

3）梯度洗脱：流速为1mL/min；柱温为30℃；检测波长，苏丹红Ⅰ为478nm，苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ为520nm，苏丹红Ⅰ出峰后切换；进样量为10μL。梯度条件见表7-7-1。

表7-7-1 梯度条件

6.标准曲线的绘制

分别吸取标准储备液0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.8mL、1.6mL，用正己烷定容至25mL（此标准系列溶液的质量浓度为0μg/mL、0.16μg/mL、0.32μg/mL、0.64μg/mL、1.28μg/mL、2.56μg/mL），以质量浓度-峰面积绘制标准曲线或计算线性回归方程。

7.结果计算

按式（7-7-5）计算苏丹红含量。

R=c×V/m （7-7-5）

式中 R——样品中苏丹红含量（mg/kg）；

c——由标准曲线（或带入线性回归方程）得出的样液中苏丹红的质量浓度（μg/mL）；

V——样液定容体积（mL）；

m——样品质量（g）。

8.试验说明

不同厂家和不同批号氧化铝的活度有差异，需根据购置的氧化铝产品略作调整。活度的调整采用标准溶液过柱，将1μg/mL的苏丹红混合标准溶液1mL加到柱中，用60mL 5%丙酮的正己烷溶液完全洗脱为准，4种苏丹红在层析柱上的流出顺序为苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅲ，可根据每种苏丹红的回收率作出判断。苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ的回收率低，表明氧化铝活性偏低；苏丹红Ⅲ的回收率低，表明氧化铝活性偏高。