三聚氰胺简称为三胺，学名为2，4，6-三胺-1，3，5-三嗪，别名有蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺，是一种重要的氮杂环有机化工原料。三聚氰胺作为一种氮杂环有机化工原料，严禁添加在食品或动物饲料中。原料乳及乳制品中三聚氰胺检测的国家标准为《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》（GB/T 22388—2008）、《原料乳中三聚氰胺快速检测 液相色谱法》（GB/T 22400—2008），其测定方法包括高效液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS法）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）等，在此介绍高效液相色谱法。
1.试验原理
试样用三氯乙酸-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，用外标法定量。
2.试剂
除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682—2008规定的一级水。
（1）常用试剂 甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、氨水（体积分数为22%～28%）、三氯乙酸、柠檬酸、辛烷磺酸钠（色谱纯）、定性滤纸、微孔滤膜（0.2μm，有机相）、氮气（纯度大于或等于99.999%）。
（2）（1+1）甲醇水溶液 准确量取50mL甲醇和50mL水，混匀后备用。
（3）三氯乙酸溶液（1%） 准确称取10g三氯乙酸置于1L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀后备用。
（4）氨化甲醇溶液（5%） 准确量取5mL氨水和95mL甲醇，混匀后备用。
（5）离子对试剂缓冲液 准确称取2.10g柠檬酸和2.16g辛烷磺酸钠，加入约980mL水溶解，调节pH值至3.0后，定容至1L备用。
（6）三聚氰胺标准品 CAS 108-78-01，纯度大于99.0%。
（7）三聚氰胺标准储备液 准确称取100mg（精确到0.1mg）三聚氰胺标准品置于100mL容量瓶中，用（1+1）甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成质量浓度为1mg/mL的标准储备液，于4℃避光保存。
（8）阳离子交换固相萃取柱 混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，填料质量为60mg，体积为3mL，或相当者。使用前依次用3mL甲醇和5mL水活化。
（9）海砂 化学纯，粒度为0.65～0.85mm，二氧化硅（SiO2）的质量分数为99%。
3.仪器
高效液相色谱仪（配有紫外检测器或二极管阵列检测器）、分析天平（感量为0.0001g和0.01g）、离心机（转速不低于4000r/min）、超声波水浴、固相萃取装置、氮气吹干仪、涡旋混合器、50mL具塞塑料离心管、研钵。
4.试验步骤
（1）高效液相色谱检测样品参考条件
1）色谱柱：C18柱，长度为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm，或相当者；C18柱，长度为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm，或相当者。
2）流动相：C18柱，（15+85）离子对试剂缓冲液-乙腈，混匀；C18柱，（10+90）离子对试剂缓冲液-乙腈，混匀。
3）流速：1mL/min。
4）温度：40℃。
5）进样体积：20μL。
6）检测器：紫外检测器或DAD检测器，波长为240nm。
根据保留时间定性，用外标峰面积法定量。
（2）样品的处理
1）提取
①液态奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等：称取2g（精确至0.01g）试样置于50mL具塞塑料离心管中，加入15mL三氯乙酸溶液和5mL乙腈，超声提取10min，再振荡提取10min后，以不低于4000r/min的转速离心10min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL滤液，加入5mL水混匀后作待净化液。
②奶酪、奶油和巧克力等：称取2g（精确至0.01g）试样置于研钵中，加入适量海砂（试样质量的4～6倍），研磨成干粉状，转移至50mL具塞塑料离心管中，用15mL三氯乙酸溶液分数次洗涤研钵，将清洗液转入离心管中，再往离心管中加入5mL乙腈，以下操作同①中“超声提取10min……加入5mL水混匀后作待净化液”。(www.xing528.com)
若样品中脂肪含量较高，则可以用三氯乙酸溶液饱和的正己烷液-液分配除脂后再用SPE柱净化。
2）净化：将1）中的待净化液转移至固相萃取柱中，依次用3mL水和3mL甲醇洗涤，抽至近干后，用6mL氨化甲醇溶液洗脱。整个萃取过程流速不超过1mL/min。将洗脱液于50℃下用氮气吹干，残留物（相当于0.4g样品）用1mL流动相定容，涡旋混合1min，过微孔滤膜后，供高效液相色谱测定用。
（3）标准曲线的绘制 将三聚氰胺标准储备液稀释得到的质量浓度为0.8μg/mL、2μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL的标准工作液，按质量浓度由低到高进样检测，以峰面积-质量浓度作图，得到标准曲线回归方程。
（4）定量测定 待测液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线范围内，若超过线性范围，则应稀释后再进样分析。
5.结果计算
（1）数据记录
（2）计算 试样中三聚氰胺的含量由色谱数据处理软件或按式（7-7-1）计算获得。
式中 X——试样中三聚氰胺的含量（mg/kg）；
A——样液中三聚氰胺的峰面积；
c——标准溶液的质量浓度（mg/L）；
V——样液最终定容体积（mL）；
As——标准溶液中三聚氰胺的峰面积；
m——样品质量（g）；
f——稀释倍数。
计算结果保留两位有效数字。
（3）精密度 在重复性条件下获得的两次独立测量结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
6.试验说明
1）乳制品中含有较多的蛋白质、脂肪等大分子物质。向试样中加入三氯乙酸、乙腈，使蛋白质被沉淀下来，然后经高速离心，上层清液经过滤定容、混匀后，经0.45μm滤膜过滤后备用。
2）流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水。流动相都应预先用小于0.5μm的滤膜过滤，脱气后才可使用。过滤时注意区分水系滤膜和有机系滤膜。
3）柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行。
4）进样器所取样品要避免带有气泡，否则过柱以后，压力降低，会放出溶解的空气，气泡将影响分离效率，使基线不稳，从而使检测器灵敏度降低，甚至不能正常工作，并且还会影响进样体积的准确性，难以保证检测结果重现性。
5）六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的75%，如20μL的定量环最多进样15μL的样品，并且要求每次进样体积准确、相同；使用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的3倍，即20μL的定量环最少进样60μL的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。在使用六通阀进样时，手柄的转动不能过缓，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力，再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。
6）为防止样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗。
7）分析测定结束后，先用体积分数为5%的甲醇溶液将离子对缓冲液冲洗干净，再用100%甲醇保存色谱柱。
8）紫外光灯是有寿命的，因此，在分析前柱平衡得差不多时，再打开检测器，并在分析完成后及时关闭检测器。
9）待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，若超过线性范围，则应稀释后再进样分析。也可采用单点对照法进行定量分析，但要求标准溶液的浓度跟待测试样溶液的浓度相接近。
10）待测样液中三聚氰胺的峰面积A为“0”时，不能报告为样品中不含三聚氰胺，而应报告为“未检出三聚氰胺”。原因为：有可能是由于样品中三聚氰胺的含量低于该方法的检测限而导致没有检出。
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