测定婴幼儿食品和乳品中的反式脂肪酸

美国食品药品监督管理局对食品中反式脂肪酸的定义为：化学结构包含一个或多个非共轭双键，构型为反式的脂肪酸。

反式脂肪酸在自然食品中含量很少，人们平时食用的含有反式脂肪酸的食品，基本上均来自人造奶油。含有氢化植物油的食品都可能含有反式脂肪酸，最常见的是烘烤食品（饼干、面包等）、沙拉酱，以及炸薯条、炸鸡块、洋葱圈等快餐食品，还有西式糕点、巧克力派、咖啡伴侣、热巧克力等。通常，商品标签上注明的“氢化植物油”“植物起酥油”“人造黄油”“人造奶油”“植物奶油”“麦淇淋”“起酥油”或“植脂末”都是可能含有反式脂肪酸的食品原材料。

图7-6-4 37种脂肪酸标准溶液典型图谱

注：不同色谱柱可能导致各种脂肪酸出峰时间不同，应以实验室单标校正的出峰顺序为准。

长期以来，人们一直认为含有反式脂肪酸的人造脂肪来自植物油，不会像动物脂肪那样导致肥胖，多吃无害。但是，近年来的研究却让人们逐渐认识到了问题的严重性。反式脂肪酸会大大增加患心血管疾病的风险，还会促生糖尿病和老年痴呆，导致生育困难，影响儿童生长发育等。因此，目前多个国家纷纷对人造脂肪的使用进行立法限制。例如，从2003年6月1日起，丹麦市场上任何人造脂肪含量超过2%的油脂都被禁用；荷兰、瑞典、德国等国家也先后制订了食品中人造脂肪的限量，同时要求食品厂商将人造脂肪的含量添加到营养标签上；2004年，美国食品药品监督管理局也规定，从2006年起，所有食品标签上的“营养成分”一栏中都要加上人造脂肪的含量，同时提醒人们，要尽可能少地摄入人造脂肪。

目前，对反式脂肪酸的分析测定方法已有很多报道，包括红外光谱、气相色谱、液相色谱和气相色谱-质谱联用等方法。我国现行的有关婴幼儿食品和乳品中反式脂肪酸的测定的国家标准《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中反式脂肪酸的测定》（GB 5413.36—2010）中的方法为气相色谱法。

1.原理

试样中的脂肪用溶剂提取，提取物在碱性条件下与甲醇反应生成脂肪酸甲酯，用配有氢火焰离子化检测器的气相色谱仪分离顺式脂肪酸甲酯和反式脂肪酸甲酯，用外标法定量。

2.试剂

除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682—2008规定的一级水。

（1）常用试剂 石油醚（沸程为30～60℃）、乙醚、乙醇（体积分数为95%）、正己烷（色谱纯）、氨水（NH₃·H₂O，质量分数为25%～28%）、氢氧化钾、甲醇、无水硫酸钠。

（2）淀粉酶 活力单位为1.5U/mg，根据活力单位大小调整用量。

（3）氢氧化钾-甲醇溶液（4mol/L） 称取26.4g氢氧化钾，溶于约80mL甲醇中，冷却至室温，用甲醇定容至100mL，然后加入约5g无水硫酸钠，充分搅拌后过滤，保留滤液。

（4）脂肪酸甲酯标准品 十八酸甲酯（C18：0）、反-9-十八碳一烯酸甲酯（C18：1-9t）、顺-9-十八碳一烯酸甲酯（C18：1-9c）、反-9，12-十八碳二烯酸甲酯（C18：2-9t，12t）、顺-9，12-十八碳二烯酸甲酯（C18：2-9c，12c），放入冰箱，在-15℃以下保存。

（5）反式脂肪酸甲酯标准储备液 质量浓度分别为10.0mg/mL。称取500mg（精确到0.1mg）反-9-十八碳一烯酸甲酯标准品和反-9，12-十八碳二烯酸甲酯标准品，分别用正己烷溶解并定容至50mL，放入冰箱，在-15℃以下保存。

（6）反式脂肪酸甲酯标准中间液 质量浓度分别为1.0mg/mL。分别吸取两种反式脂肪酸甲酯标准储备液10.0mL放入同一100mL容量瓶中，并用正己烷（色谱纯）定容。此溶液需临用前配制。此溶液浓度也可作为标准曲线最高浓度。

（7）反式脂肪酸甲酯标准工作液 临用前配制。分别吸取反式脂肪酸甲酯标准中间液0.00mL、2.00mL、4.00mL、6.00mL、8.00mL、10.00mL置于10mL容量瓶中，用正己烷（色谱纯）定容，即得质量浓度即为0mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的标准工作液。

（8）脂肪酸甲酯标准混合液 将脂肪酸甲酯标准品用正己烷（色谱纯）配制成脂肪酸甲酯标准混合溶液，其中每种成分的质量浓度约为0.05～0.5mg/mL。此溶液用于顺、反脂肪酸甲酯分离程度及定性的鉴定。

（9）刚果红溶液 称取1g刚果红溶解并稀释至100mL。

3.仪器

气相色谱仪（带氢火焰离子化检测器）、旋转蒸发仪、恒温水浴（温度为40～80℃）、涡旋振荡器、离心机（转速大于或等于4000r/min）、毛氏抽脂瓶、毛氏抽脂瓶摇混器、脂肪收集瓶（圆底烧瓶，与旋转蒸发仪配套）、天平（感量为0.1mg）。

4.试验步骤

（1）试样的处理

1）含淀粉的试样：称取1.5g混合均匀的固体试样或5g液体试样（精确到0.1mg）置于毛氏抽脂瓶中，加入约0.1g淀粉酶（酶活力为1.5U/mg），混合均匀后，放入8～10mL 45℃±2℃水浴中保温2h，每隔10min摇混一次，加入两滴约0.1mol/L的碘溶液，检验淀粉是否水解完全。若无蓝色，则说明水解完全；否则将毛氏抽脂瓶重新置于水浴中，直至蓝色消失，取出冷却至室温。

2）不含淀粉的试样：称取1.5g混合均匀的固体试样或10g液体试样（精确到0.1mg）置于毛氏抽脂瓶中，加入10mL 45℃±2℃的水，将试样洗入毛氏抽脂瓶的小球中，充分混合，直到试样完全散开，冷却至室温。

3）脂肪的提取：向毛氏抽脂瓶中加入3.0mL氨水，混匀，置于60℃±2℃水浴中保温15～20min，然后冷却至室温，加入10mL乙醇和1滴刚果红溶液，混匀，再加入25mL乙醚，塞上软木塞，放到毛氏抽脂瓶摇混器上振荡1min，也可采用手动振摇方式，再加入25mL石油醚，振荡1min，以不低于4000r/min的转速离心分层。倾出上清液于脂肪收集瓶中，为第一次提取。在剩余样液中再加入5mL乙醇、25mL乙醚、25mL石油醚，按上述操作步骤进行第二次提取。用离心机离心分层后倾出上清液，将其与第一次的上清液合并。将脂肪收集瓶置于旋转蒸发仪上，在60℃±2℃通入氮气的条件下旋转蒸发除去溶剂，保留残渣，即得脂肪。

4）脂肪酸甲酯的制备：将上述脂肪用正己烷溶解并定容至10mL，从中取出3.0mL置于10mL具塞试管中，加入0.3mL氢氧化钾-甲醇溶液，盖紧瓶盖，置于涡旋振荡器上剧烈振摇2min，以4000r/min的转速离心5min后将上清液转入气相色谱试样瓶中，此为试样测定液。

（2）测定

1）色谱条件

①色谱柱：填料为氰丙基芳基聚硅氧烷的毛细管柱，柱长度为100m，内径为0.25mm，膜厚度为0.2μm，或同等性能的色谱柱。

②进样口温度：250℃。载气为氮气。(www.xing528.com)

③检测器温度：300℃。

④分流比：10∶1。

⑤进样量：1.0μL。

⑥程序升温：见表7-6-3。

表7-6-3 程序升温

2）标准曲线的制备：在仪器最佳工作条件下，对系列标准工作液分别进样，以峰面积为纵坐标，标准工作液的质量浓度为横坐标，绘制标准工作曲线。

3）反式脂肪酸甲酯色谱峰的鉴别：对脂肪酸甲酯标准混合溶液进样，进行顺、反脂肪酸甲酯分离程度及定性的鉴定。反十八碳一烯酸甲酯和反十八碳二烯酸甲酯色谱峰的位置见试验说明。

4）样液的测定：将试样测定液注入气相色谱仪，分别测定区域C18：1t和区域C18：2t的峰面积，查标准曲线得到试样测定液中反十八碳一烯酸甲酯和反十八碳二烯酸甲酯的质量浓度。

5.结果计算

试样中反十八碳一烯酸和反十八碳二烯酸的含量按式（7-6-7）计算。

式中 X（1或2）——试样中反十八碳一烯酸或反十八碳二烯酸的含量（mg/100g）；

V——试样的定容体积（mL）；

m——试样的质量（g）；

c_i——试样测定液中反十八碳一烯酸甲酯或反十八碳二烯酸甲酯的质量浓度（mg/mL）；

M_ai——反十八碳一烯酸或反十八碳二烯酸的相对分子质量；

M_bi——反十八碳一烯酸甲酯或反十八碳二烯酸甲酯的相对分子质量。

试样中反式脂肪酸的总含量为

X=X₁+X₂ （7-6-8）

式中 X——反式脂肪酸的总含量（mg/100g）；

X₁——试样中反十八碳一烯酸的含量（mg/100g）；

X₂——试样中反十八碳二烯酸的含量（mg/100g）。

结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，保留三位有效数字。

6.精密度

重复试验条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

7.试验说明

1）本标准检出限为：反式脂肪酸总含量30mg/kg。

2）反式脂肪酸混合标准溶液气相色谱图，如图7-6-5所示。

3）植物油和含植物油食品中反式脂肪酸含量的测定可参照《食品中反式脂肪酸的测定 气相色谱法》（GB/T 22110—2008）。其样品中反式脂肪酸最低检测限为0.05%（以脂肪计）。