咖啡因又名咖啡碱，属于甲基黄嘌呤化合物，化学名称为1，3，7-三甲基黄嘌呤，具有提神醒脑等刺激中枢神经的作用，但易上瘾。为此，各国制定了咖啡因的食品卫生标准。美国、加拿大、阿根廷、日本、菲律宾规定饮料中咖啡因的含量不得超过200mg/L。到目前为止，我国仅允许咖啡因加入到可乐型饮料中，其含量不得超过0.15g/kg。要加强食品卫生监督管理，建立咖啡因的标准测定方法十分必要。其检测方法主要有高效液相色谱法和紫外可见分光光度法。其中，紫外可见分光光度法是《饮料中咖啡因的测定》（GB/T 5009.139—2003）规定的仲裁方法。
1.原理
咖啡因的三氯甲烷溶液在276.5nm波长下有最大吸收，其吸收值与咖啡因浓度成正比，从而可进行定量。
2.试剂与仪器
（1）试剂 本标准所用试剂均为分析纯试剂，试验用水为蒸馏水。
1）无水硫酸钠。
2）三氯甲烷：使用前重新蒸馏。
3）15g/L高锰酸钾溶液：称取1.5g高锰酸钾，用水溶解并稀释至100mL。
4）亚硫酸钠和硫氰酸钾混合溶液：称取10g无水亚硫酸钠（Na2SO3），用水溶解并稀释至100mL，另取10g硫氰酸钾，用水溶解并稀释至100mL，然后将两者均匀混合。
5）15%磷酸溶液：吸取15mL磷酸置于100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。
6）200g/L氢氧化钠溶液；称取20g氢氧化钠，用水溶解，冷却后稀释至100mL。
7）200g/L乙酸锌溶液：称取20g乙酸锌[Zn（CH3COO）2·2H2O]，加入3mL冰乙酸，用水溶解并稀释至100mL。
8）100g/L亚铁氰化钾溶液：称取10g亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6·3H2O]，用水溶解并稀释至100mL。
9）咖啡因标准品；质量分数在98.0%以上。
10）咖啡因标准储备液：根据咖啡因标准品的含量，用重蒸三氯甲烷配制成每毫升相当于0.5mg咖啡因的溶液，置于冰箱中保存。
（2）仪器 紫外分光光度计。
3.试样的处理
（1）可乐型饮料 在250mL分液漏斗中，准确移入10.0～20.0mL超声脱气后的均匀可乐型饮料试样，加入15g/L高锰酸钾溶液5mL，摇匀，静置5min，再加入混合溶液10mL，摇匀，然后加入50mL重蒸三氯甲烷，振摇100次，静止分层，收集三氯甲烷。向水层中加入40mL重蒸三氯甲烷，振摇100次，静置分层。合并二次三氯甲烷萃取液，并用重蒸三氯甲烷定容至100mL，摇匀，备用。(www.xing528.com)
（2）咖啡、茶叶及其固体试样 称取粉碎成低于30目的均匀样品0.5～2.0g，置于100mL烧杯中，加入80mL沸水，加盖，摇匀，浸泡2h，然后将浸出液全部移入100mL容量瓶中，加入200g/L乙酸锌溶液2mL、100g/L亚铁氰化钾溶液2mL，摇匀，用水定容至100mL，摇匀，静置沉淀，过滤。取滤液5.0～20.0mL，按“可乐型饮料”操作进行，制备成100mL三氯甲烷溶液，备用。
（3）咖啡或茶叶的液体试样 向100mL容量瓶中准确移入10.0～20.0mL均匀样品，加入200g/L乙酸锌溶液2mL，摇匀，再加入100g/L亚铁氰化钾溶液2mL，摇匀，用水定容至100mL，摇匀，静置沉淀，过滤。取滤液5.0～20.0mL，按“可乐型饮料”操作进行，制备成100mL三氯甲烷溶液，备用。
4.标准曲线的绘制
从0.5mg/mL的咖啡因标准储备液中，用重蒸三氯甲烷配制成浓度分别为0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL的标准系列溶液，以0μg/mL作参比管，调节零点，用1cm比色杯置于276.5nm下测量吸光度，绘制吸光度-咖啡因浓度的标准曲线或求出直线回归方程。
5.测定
在25mL具塞试管中，加入5g无水硫酸钠，倒入20mL试样的三氯甲烷制备液，摇匀，静置。将澄清的三氯甲烷用1cm比色杯于276.5nm测出其吸光度，根据标准曲线（或直线回归方程）求出样品的吸光度相当于咖啡因的质量浓度c（μg/mL），同时用重蒸三氯甲烷作试剂空白。
6.结果计算
式中 X1——可乐型饮料中咖啡因的含量（mg/L）；
X2——咖啡、茶叶及其固体试样中咖啡因的含量（mg/100g）；
X3——咖啡、茶叶的液体试样中咖啡因的含量（mg/L）；
c——试样吸光度相当于咖啡因的质量浓度（μg/mL）；
c0——试剂空白吸光度相当于咖啡因的质量浓度（μg/mL）；
V——移取试样的体积（mL）；
V1——移取试样处理后水溶液的体积（mL）；
m——称取试样的质量（g）。
可乐型饮料咖啡：在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。咖啡、茶叶及其制品：在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
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