食品加工过程中常添加一些化学物质与食品中某些成分作用，而使产品呈现良好的色泽。这些物质称为护色剂，又称为发色剂或呈色剂。护色剂与色素的区别在于护色剂通过化学反应使食品保持本色。目前我国食品中常用的护色剂有亚硝酸盐和硝酸盐，它能够使肉与肉制品呈现良好色泽。除了发色外，亚硝酸钠还具有较强的抑菌作用，尤其是抑制肉毒梭状芽孢杆菌的生长（pH=6），因此亚硝酸钠又是防腐剂。
亚硝酸盐是强氧化剂，进入血液中，可使二价铁离子氧化为三价铁离子，使正常血红蛋白转变为高铁血红蛋白，失去携氧能力，出现亚硝酸盐中毒症状；也可与胺类物质生成强致癌物亚硝胺。硝酸盐在细菌作用下可还原为亚硝酸盐，若饮水中含有100mg/kg（以NO3-计），即可引起婴儿中毒。对于这样一类毒性确定的食品添加剂，我国对其有严格的限量规定。根据《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2011），在腌腊肉制品类、酱卤肉制品类、熏烧烤肉类、油炸肉类、西式火腿类、肉灌肠类、发酵肉制品类、肉罐头等各类熟肉制品的生产过程中，亚硝酸盐的最大使用量均为0.15g/kg，以亚硝酸钠计的残留量除西式火腿类应小于或等于70mg/kg，肉罐头类应小于或等于50mg/kg外，其余肉制品中残余量均应小于或等于30mg/kg。现行的测定方法依据《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》（GB 5009.33—2010），盐酸萘乙二胺分光光度法为其第二法。
1.原理
试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，用外标法测得亚硝酸盐含量。
2.试剂与仪器
（1）试剂 除非另有规定，所用试剂均为分析纯。水为GB/T 6682—2008规定的二级水或去离子水。
1）亚铁氰化钾溶液（106g/L）：称取106.0g亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6·3H2O]，用水溶解，并稀释至1000mL。
2）乙酸锌溶液（220g/L）：称取220.0g乙酸锌[Zn（CH3COO）2·2H2O]，先加30mL冰乙酸溶解，再用水稀释至1000mL。
3）饱和硼砂溶液（50g/L）：称取5.0g硼酸钠（Na2B4O7·10H2O），溶于100mL热水中，冷却后备用。
4）盐酸（0.1mol/L）：量取5mL盐酸（ρ=1.19g/mol），用水稀释至600mL。
5）对氨基苯磺酸溶液（4g/L）：称取0.4g对氨基苯磺酸，溶于100mL体积分数为20%的盐酸中，置于棕色瓶中混匀，避光保存。
6）盐酸萘乙二胺溶液（2g/L）：称取0.2g盐酸萘乙二胺（C12H14N2·2HCl），溶于100mL水中，混匀后置于棕色瓶中，避光保存。
7）亚硝酸钠标准溶液（200μg/mL）：准确称取0.1000g于110～120℃干燥至恒重的亚硝酸钠，加水溶解，移入500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。
8）亚硝酸钠标准使用液（5.0μg/mL）：临用前吸取亚硝酸钠标准溶液5.00mL，置于200mL容量瓶中，加水稀释至刻度。
（2）仪器和设备 天平（感量为0.1mg和1mg）、组织捣碎机、超声波清洗器、恒温干燥箱、分光光度计。
3.分析步骤
（1）试样预处理
1）新鲜蔬菜、水果：将试样用去离子水洗净，晾干后，取可食部切碎混匀。将切碎的样品用四分法取适量，用食物粉碎机制成匀浆备用。若需加水，则应记录加水量。
2）肉类、蛋、水产及其制品：用四分法取适量或取全部，用食物粉碎机制成匀浆备用。
3）乳粉、豆奶粉、婴儿配方粉等固态乳制品（不包括干酪）：将试样装入能够容纳2倍试样体积的带盖容器中，通过反复摇晃和颠倒容器使样品充分混匀，直到使试样均一化。
4）发酵乳、乳、炼乳及其他液体乳制品：通过搅拌或反复摇晃和颠倒容器使试样充分混匀。
5）干酪：取适量的样品研磨成均匀的泥浆状。为避免水分损失，在研磨过程中应避免产生过多的热量。
（2）提取 称取5g（精确至0.01g）制成匀浆的试样（若制备过程中加水，则应按加水量折算），置于50mL烧杯中，加12.5mL饱和硼砂溶液，搅拌均匀，以70℃左右的水约300mL将试样洗入500mL容量瓶中，于沸水浴中加热15min，取出，置于冷水浴中冷却，并放置至室温。(www.xing528.com)
（3）提取液净化 在振荡上述提取液时加入5mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5mL乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。加水至刻度，摇匀，放置30min，除去上层脂肪，上清液用滤纸过滤，弃去初滤液30mL，剩余滤液备用。
（4）测定
1）标准曲线的绘制：吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL亚硝酸钠标准使用液（相当于0.0μg、1.0μg、2.0μg、3.0μg、4.0μg、5.0μg、7.5μg、10.0μg、12.5μg亚硝酸钠），分别置于50mL带塞比色管中，加入2mL对氨基苯磺酸溶液（4g/L），混匀，静置3～5min后各加入1mL盐酸萘乙二胺溶液（2g/L），加去离子水至刻度，混匀，静置15min，用2cm比色杯，以零管调节零点，于波长538nm处测吸光度，绘制标准曲线。
2）样品的测定：吸取40.0mL上述滤液置于50mL带塞比色管中，加入2mL对氨基苯磺酸溶液（4g/L），混匀，静置3～5min后加入1mL盐酸萘乙二胺溶液（2g/L），加去离子水至刻度，混匀，静置15min，用2cm比色杯，以零管调节零点，于波长538nm处测吸光度。从标准曲线上查得稀释样品中的亚硝酸钠含量。
4.结果计算
亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）的含量按式（7-3-1）计算。
式中 X——试样中亚硝酸钠的含量（mg/kg）；
m1——测定用样液中亚硝酸钠的质量（μg）；
m——试样质量（g）；
V1——测定用样液体积（mL）；
V0——试样处理液的总体积（mL）。
结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，并保留两位有效数字。
5.精密度
在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对值差不得超过算术平均值的10%。
6.试验说明
1）亚铁氰化钾和乙酸锌溶液作为蛋白质沉淀剂，使产生的亚铁氰化锌沉淀与蛋白质产生共沉淀。
2）饱和硼砂溶液的作用：一是亚硝酸盐提取剂，二是蛋白质沉淀剂。
3）亚硝酸钠易被氧化为硝酸钠，因此应注意加热的温度和时间。
4）显色时的pH值以1.9～3.0为宜，显色后稳定性与室温有关，显色温度为15～30℃，在15～30min内比色为好。
5）当样品中亚硝酸盐含量高时，过量的亚硝酸盐可以将生成的偶氮化合物氧化，使红色消失，对结果产生影响。可以采取先放入试剂，然后再滴加试液的方法，以防止氧化。
6）盐酸萘乙二胺有致癌作用，使用时应注意安全。
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