蛋白质测定及其在食品加工中的应用

蛋白质是由多种不同的α-氨基酸通过肽链相互连接而成的，并具有多种多样的二级和三级结构。不同的蛋白质具有不同的氨基酸组成。

从组成上看：化学元素有C、H、O、N等，官能基团有肽键、氨基酸残基、酸碱基团、芳香基团等。因此，含氮是蛋白质区别于其他有机物的主要标志。

不同食品中的蛋白质含氮量不同，蛋白质的量与氮含量的关系用蛋白质系数F表示。蛋白质系数——每份氮素相当于的蛋白质的份数。一般蛋白质含氮为16%（质量分数），所以1份氮素相当于6.25份蛋白质。以下是部分食品的蛋白质系数F：

玉米、荞麦、青豆、鸡蛋 6.25

花生 5.46

大米 5.95

大豆及其制品 5.71

小麦粉 5.70

牛乳及其制品 6.38

蛋白质是生物体细胞的重要组成成分，在生物体系中起着核心作用。蛋白质也是食品中一种重要的产能营养素，并提供人体必需的氨基酸。蛋白质还对食品的质构、风味和加工产生影响。

乳、肉、水产品、蛋、谷物、豆类和油料种子都是食品蛋白质的主要来源。为了满足人类对食品蛋白质日益增长的需要，不仅要寻找新的食品蛋白质资源和开发利用蛋白质的技术方法，而且还应提高对常规蛋白质的利用率和性能的改进，因此了解蛋白质的物理、化学、营养和功能性质，具有重要的实际意义。

蛋白质的功能性质在食品中得到了极其广泛的应用。例如：制造蛋糕时就充分地利用了卵蛋白的乳化性、搅打起泡性和热凝聚作用。蛋白质的功能性质是在食品加工实践、模型体系试验和蛋白质结构特征和功能关系分析研究等多重基础上逐步探明的。系统地测定各种食品蛋白质（包括新开发的食品蛋白质产品）的功能性质有助于在食品加工业中正确地使用这些蛋白质资源，而探明、解释、把握和改进食品蛋白质的功能性质就可研究一种新的食品配方和新的加工工艺。风味物质能够部分被吸附或结合在食品的蛋白质中，豆腥味、酸败味和苦涩味物质等不良风味物质的结合常会降低蛋白质的食用性质，而肉的风味物质和其他风味物质的可逆结合，可使食品在保藏和加工过程中保持其风味。

因此，蛋白质含量的测定具有重要的意义：评价食品的营养价值，开发利用食品资源，指导生产，优化食品配方，提高产品质量。

测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。蛋白质测定最常用的方法是凯氏定氮法。它是测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之一，在国内外应用普遍。此外，双缩脲分光光度比色法、染料结合分光光度比色法、酚试剂法等也常用于蛋白质含量的测定，由于方法简便快速，多用于生产单位质量控制分析。近年来，国外采用红外检测仪对蛋白质进行快速定量分析。

1.凯式定氮法检测食品中的蛋白质（GB 5009.5—2010）

凯氏定氮法由Kieldahl于1833年首先提出，经长期改进，迄今已演变成常量法、微量法、改良凯氏定氮法、自动定氮仪法、半微量法等多种方法。

（1）原理 将样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨，并与硫酸结合成硫酸铵，此过程称为消化。加碱将消化液碱化，使氨游离出来，再通过水蒸气蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收形成硼酸铵，再以标准盐酸或硫酸溶液滴定，根据标准盐酸消耗量可计算出蛋白质的含量。

1）消化：消化反应方程式为

2NH₂（CH₂）₂COOH+13H₂SO₄

=（NH₄）₂SO₄+6CO₂↑+12SO₂↑+16H₂O

浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水并炭化为碳、氢、氮。浓硫酸又有氧化性，使炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫。

二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。

H₂SO₄+2NH₃=（NH₄）₂SO₄

在消化反应中，为了加速蛋白质的分解，缩短消化时间，常加入下列催化剂：

①硫酸钾：加入硫酸钾的目的是提高溶液的沸点，加快有机物的分解。硫酸钾与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度。一般纯硫酸的沸点在340℃左右，而添加硫酸钾后，可使温度提高至400℃以上，而且随着消化过程中硫酸不断地被分解，水分不断逸出而使硫酸氢钾的浓度逐渐增大，故沸点不断升高。其反应式如下：

所以硫酸钾的加入量也不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解，析出氨而造成损失。

除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。

②硫酸铜CuSO₄：硫酸铜起催化剂的作用。凯氏定氮法中可用的催化剂种类很多，除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉等，但考虑到效果、价格及环境污染等多种因素，应用最广泛的是硫酸铜。使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂，以加速有机物的氧化分解。硫酸铜的作用机理如下：

此反应不断进行，待有机物全部被消化完后，不再有硫酸亚铜（Cu₂SO₄褐色）生成，溶液呈现清澈的二价铜的蓝绿色。故硫酸铜除起催化剂的作用外，还可指示消化终点的到达，以及下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。

2）蒸馏：在消化完全的样品消化液中加入浓氢氧化钠使其呈碱性，此时氨游离出来，加热蒸馏即可释放出氨气。反应方程式如下：

2NaOH+（NH₄）₂SO₄=2NH₃↑+Na₂SO₄+2H₂O

3）吸收与滴定：蒸馏所释放出来的氨，用硼酸溶液进行吸收，硼酸呈微弱酸性（K_a1=5.8×10^-10），与氨形成强碱弱酸盐，待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定。吸收及滴定反应方程式如下：

2NH₃+4H₃BO₃=（NH₄）₂B₄O₇+5H₂O

（NH₄）₂B₄O₇+5H₂O+2HCl=2NH₄Cl+4H₃BO₃

蒸馏释放出来的氨，也可以采用硫酸或盐酸标准溶液吸收，然后再用氢氧化钠标准溶液反滴定吸收液中过剩的硫酸或盐酸，从而计算出总氮量。此方法可应用于各类食品中蛋白质含量的测定。

（2）所需试剂 所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682—2008规定的三级水。

1）常见试剂：硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）、硫酸钾（K₂SO₄）、硫酸（H₂SO₄，密度为1.84g/L），硼酸（H₃BO₃）、甲基红指示剂（C₁₅H₁₅ N₃O₂）、溴甲酚绿指示剂（C₂₁H₁₄Br₄O₅S）、亚甲基蓝指示剂（C₁₆H₁₈ CiN₃S·3H₂O）、氢氧化钠（NaOH）、95%乙醇（C₂H₅OH）。

2）硼酸溶液（20g/L）：称取20g硼酸，加水溶解后稀释至1000mL。

3）氢氧化钠溶液（400g/L）：称取40g氢氧化钠加水溶解后，放冷，稀释至100mL。

4）硫酸标准滴定溶液（0.0500mol/L）或盐酸标准滴定溶液（0.0500mol/L）。

5）甲基红乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g甲基红，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL。

6）亚甲基蓝乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g亚甲基蓝，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL。

7）溴甲酚绿乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g溴甲酚绿，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL。

8）混合指示液：2份甲基红乙醇溶液与1份亚甲基蓝乙醇溶液临用时混合，也可用1份甲基红乙醇溶液与5份溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。

（3）所需仪器 天平（感量为1mg）、定氮蒸馏装置、自动凯氏定氮仪。

（4）样品的处理 固体样品要粉碎成粉末，不易粉碎的固体样品要尽量切碎；液体样品要混合均匀。

图7-2-1 凯氏定氮消化装置

1—电炉 2—定氮瓶

（5）测定

1）消化：准确称取固体样品0.2～2g（半固体样品2～5g，液体样品10～20mL），小心移入干燥洁净的100mL、250mL或500mL定氮瓶中，加入研细的硫酸铜0.2g、硫酸钾6g和硫酸20mL，轻轻于瓶口放一支小漏斗（见图7-2-1），并将其以45°斜支于有小孔的石棉网上。用电炉以小火加热，待内容物全部炭化，泡沫停止产生后，加大火力，保持瓶内液体微沸，至液体变蓝绿色并澄清透明后，再继续加热0.5～1h。取下冷却，小心加入20mL蒸馏水，再放冷，转移至100mL容量瓶，并用少量水洗定氮瓶，将洗液也转移至容量瓶，定容。同时做试剂空白试验。

2）蒸馏：将凯氏定氮瓶按图7-2-2所示方式连好。向水蒸气发生器内装水至2/3处，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇溶液数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生器内的水并使其保持沸腾。塞紧瓶口，将冷凝管下端插入接收瓶液面下（瓶内预先装入10mL 20g/L硼酸溶液及混合指示剂1滴或2滴）。准确吸取2.0～10.0mL试样的处理液由小玻璃杯注入反应室，以10mL水洗涤小玻璃杯并使之流入反应室内，随后塞紧棒状玻璃塞。将10mL 400g/L氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓缓流入反应室，立即将玻璃塞盖紧，并加水于小玻璃杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。

图7-2-2 定氮蒸馏装置(www.xing528.com)

1—电炉 2—水蒸气发生器（2L烧瓶） 3—螺旋夹 4—小玻璃杯及棒状玻璃塞 5—反应室 6—反应室外层 7—橡胶管及螺旋夹8—冷凝管9—蒸馏液接收瓶

蒸馏10min后移动蒸馏液接收瓶，使液面离开冷凝管下端，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶。

3）滴定：以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定至终点。同时作试剂空白。

终点突变颜色：2份甲基红乙醇溶液与1份亚甲基蓝乙醇溶液指示剂，颜色由紫红色变成灰色，pH=5.4；1份甲基红乙醇溶液与5份溴甲酚绿乙醇溶液指示剂，颜色由酒红色变成绿色，pH=5.1。

（6）结果计算 食品中蛋白质的含量按照式（7-2-1）计算。

式中 X——蛋白质的质量分数；

c——HCl标准溶液的浓度（mol/L）；

V₁——滴定样品吸收液时消耗盐酸标准溶液的体积（mL）；

V₂——滴定空白吸收液时消耗盐酸标准溶液的体积（mL）；

V₃——吸取消化液的体积（mL）；

m——样品质量（g）；

0.0140——1.0mL硫酸[c（1/2H₂SO₄）=1.000mol/L]或盐酸[c（HCl）=1.000mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量（g/mmol）；

F——氮换算为蛋白质的系数。

蛋白质的系数：一般食物为6.25；纯乳与纯乳制品为6.38；面粉为5.70；玉米、高粱为6.24；花生为5.46；大米为5.95；大豆及其粗加工制品为5.71；大豆蛋白制品为6.25；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵为5.30；复合配方食品为6.25。

结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示。当蛋白质含量大于或等于1g/100g时，结果保留三位有效数字；当蛋白质含量小于1g/100g时，结果保留两位有效数字。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

（7）注意事项

1）所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。

2）消化时不要用强火，应保持缓和沸腾，并注意不断转动凯氏定氮瓶，以利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全。

3）样品中若含脂肪或糖较多，则在消化过程中易产生大量泡沫。为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并不断摇动，或者加入少量辛醇或液状石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。

4）当样品消化液不易澄清透明时，可冷却凯氏定氮瓶，加入质量分数为30%的过氧化氢2～3mL，再继续加热消化。

5）若取样量较大（如干试样超过5g），则可按每克试样5mL的比例增加硫酸用量。

6）一般消化至溶液透明后，继续消化30min即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物（如赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等）的样品，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深的绿色。

7）蒸馏装置不能漏气。

8）蒸馏前若加碱量不足，则消化液呈蓝色，不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。

9）硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则会因对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中使用。

10）蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1min后关掉热源，否则可能造成吸收液倒吸。

11）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。

12）因为消化过程中的温度可达400℃，所以操作时要注意，不要被烫伤。

13）消化过程中会产生二氧化硫等有毒气体，所以一定要在通风橱中进行消化，还要保持实验室通风良好，避免中毒。

14）消化结束后，不要把定氮瓶直接放在试验台上，一是因为温度高会烫坏试验台，二是因为定氮瓶遇冷会炸裂。应把定氮瓶放在木质的支架上，直到冷却至室温。

2.蛋白质的快速检测法（双缩脲分光光度比色法）

蛋白质的快速检测法有双缩脲分光光度比色法、染料结合分光光度比色法、水杨酸比色法、折光法、旋光法及近红外光谱法等。新一代微电脑的智能化分光光度计具有浓度直读功能及数据处理能力，能自动地将检测样品与标准进行比较，并直接给出样品的浓度。本方法灵敏度较低，但操作简单、快速，故常用在生物化学领域中测定蛋白质的含量。本方法也适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品的测定。

（1）原理 当脲被小心地加热至150～160℃时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成二缩脲（也叫双缩脲）。双缩脲与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配位化合物，此反应称为双缩脲反应。

由于蛋白质分子中含有肽键（—CO—NH—），与双缩脲结构相似，故也能呈现此反应而生成紫红色配位化合物。在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，据此可用吸收光度法来测定蛋白质含量。该配位化合物的最大吸收波长为560nm。

（2）所需试剂

1）碱性硫酸铜溶液

①以甘油作稳定剂：将10mL 10mol/L的氢氧化钾和3.0mL甘油加到937mL蒸馏水中，剧烈搅拌，同时慢慢加入50mL 40g/L的硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）溶液。

②以酒石酸钾钠作稳定剂：将10mL 10mol/L的氢氧化钾和20mL 250g/L的酒石酸钾钠溶液加到930mL蒸馏水中，剧烈搅拌，同时慢慢加入40mL 40g/L的硫酸铜溶液。

加入硫酸铜溶液时，必须剧烈搅拌，否则将生成氢氧化铜沉淀。

2）四氯化碳（CCl₄）。

（3）所需仪器 分光光度计、离心机（转速为4000r/min）。

（4）测定

1）标准曲线的绘制：以用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质样。按蛋白质质量40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg分别称取混合均匀的标准蛋白质样品置于8支50mL纳氏比色管中，然后各加入1mL四氯化碳，再用碱性硫酸铜溶液（①或②）准确稀释至50mL，振摇10min，静置1min，取上层清液离心5min，取离心分离后的透明液置于比色皿中，在560nm波长下以蒸馏水作参比液调节仪器零点并测定各溶液的吸光度。以蛋白质的质量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

2）样品的测定：准确称取适量样品（使蛋白质质量在40～110mg之间）置于50mL纳氏比色管中，加1mL四氯化碳，按上述步骤显色后，在相同条件下测其吸光度。用测得的吸光度在标准曲线上即可查得蛋白质毫克数，进而由此求得蛋白质含量。

（5）计算

式中 X——样品中蛋白质的含量（mg/100g）；

m₁——由标准曲线上查得的蛋白质质量（mg）；

m——样品质量（g）。

（6）注意事项

1）蛋白质的种类不同，对发色程度的影响也就不同。

2）标准曲线绘制完整之后，无需每次再绘制标准曲线。

3）脂肪含量高的样品应预先用醚抽出弃去。

4）样品中有不溶性成分存在时，会给比色测定带来困难，此时可预先将蛋白质抽出后再进行测定。

5）当肽链中含有脯氨酸时，若有多量糖类共存，则显色不好，会使测定值偏低。