微生物检验器皿的消毒灭菌方法优化建议：

微生物检验无菌技术的基础是检验所用的培养基、器皿、用具等都必须是无菌的。消毒灭菌技术也是微生物最基本的试验技术之一。

借助于不同的消毒和灭菌技术手段，可不同程度地减少或完全杀灭环境中的微生物。这是从事微生物检验工作的基础。例如，通过高温灭菌来杀死培养基内和所用器皿中的一切微生物；借助紫外线的杀菌作用，可进行工作室、接种室的空气消毒；许多化学药剂对微生物有毒害和致死作用，常用作灭菌剂及消毒剂等。

消毒与灭菌的方法很多，可分为物理法和化学法两大类。物理法包括加热灭菌（干热灭菌和湿热灭菌）、过滤除菌、紫外线辐射灭菌等。化学法主要是利用无机或有机化学药剂对试验用具和其他物体表面进行消毒与灭菌。可根据微生物的特点、待灭菌材料与试验目的和要求来选用具体的方法。一般来说，玻璃器皿可用干热灭菌；培养基用高压蒸汽灭菌，某些不耐高温的培养基如血清、牛乳等可用巴斯德消毒法、间歇式灭菌法或过滤除菌法；无菌室和无菌罩等可用紫外线辐射、化学药剂喷雾或熏蒸等方法灭菌。

1.消毒灭菌的几个概念

（1）灭菌 它是采用强烈的理化因素杀死物体表面及内部所有微生物（包括病原微生物和非病原微生物）繁殖体及芽孢的过程。灭菌后的物体不再有任何可存活的微生物营养体及其芽孢、孢子，即处于无菌状态，否则就是灭菌不彻底。

（2）消毒 它是用较为温和的理化因素仅杀死物体表面或内部一部分对人或动植物有害的病原微生物，而对被消毒的对象基本无害的措施。具有消毒作用的药物称为消毒剂。一般消毒剂在常用浓度下只对细菌的营养体有效，对细菌的芽孢则无杀灭作用。

（3）无菌 无菌是指不含活的微生物。只有通过彻底灭菌，才能达到无菌要求。灭菌是无菌的先决条件，无菌是灭菌的后果。食品微生物检验操作必须在无菌环境中用无菌操作进行。

（4）防腐 防腐是利用理化因素完全抑制微生物的生长繁殖，防止食品、生物制品等霉变腐败的措施。用于防腐的药物称防腐剂。某些药物在低浓度时为防腐剂，在高浓度时为消毒剂。低温、干燥、无氧、高渗透压等都是常用的防腐措施。

2.干热灭菌法

通过使用干热空气杀灭微生物的方法称为干热灭菌法。干热灭菌包括烘箱热空气灭菌和火焰灼烧灭菌两种方法。

（1）烘箱热空气灭菌 它是将耐热待灭菌物品放于鼓风干燥箱内，利用热空气进行灭菌的方法。由于空气的传热性和穿透力不及饱和蒸汽，加上菌体在脱水的情况下又不易被热能杀死，所以烘箱热空气灭菌需要较高的温度和较长的时间，一般160℃加热2h。灭菌时间可根据被灭菌物品的体积进行适当调整。此方法适用于对体积较大的玻璃器皿、金属器皿和其他耐干燥的物品进行灭菌，如培养皿、锥形瓶、吸管、烧杯、金属用具等。这种方法的优点是能使灭菌物品保持干燥。

烘箱热空气灭菌法的基本操作步骤如下：

1）装入待灭菌物品：将包好的待灭菌物品（如培养皿、试管、吸管等）放入电烘箱内，物品不要摆放得太挤，以免妨碍热空气流通。同时，灭菌物品也不要与电烘箱内壁的铁板接触，以防包装纸烤焦起火。

2）升温：接通电源，打开开关，打开电烘箱排气孔，旋动恒温调节器至绿灯亮，让温度逐渐上升。当温度升至100℃时，关闭电烘箱排气孔。在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，则表示电烘箱内停止升温。此时如果还未达到所需温度，则需转动调节器使红灯再亮。如此反复调节，直至达到所需温度。

3）恒温：当温度升到160～170℃时，借恒温调节器的自动控制，保持此温度2h。在干热灭菌过程中，严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。

4）降温：切断电源，自然降温。

5）开箱取物：待电烘箱内的温度降到70℃以下后，打开箱门，取出灭菌物品。

注意：在电烘箱内温度未降到70℃以前，切勿自行打开箱门，以防骤然降温而导致玻璃器皿炸裂。

采用烘箱热空气灭菌时要注意：玻璃器皿要先洗净、干燥，然后用纸正确包裹和加塞，而后才能放入烘箱中灭菌，以保证玻璃器皿灭菌后不被外界杂菌污染；金属器皿要放入带盖磁盘或其他耐热容器内进行灭菌；升温或降温不能过急；箱温不要超过180℃，以免包装纸自燃；箱内温度降到60℃以下时才能开箱取物；灭菌后的物品应随用随打开包装纸。

（2）火焰灼烧灭菌 它是将待灭菌物品在酒精灯火焰中灼烧，以杀死其中的微生物的灭菌方法。这是一种最简便、快捷的干热灭菌方法，但只适用于体积较小的金属器皿或玻璃仪器，如接种环、接种针、试管口或玻璃棒的灭菌。

3.湿热灭菌法

湿热灭菌法是一种用煮沸或饱和热蒸汽杀死微生物的方法。与干热灭菌法相比，其灭菌温度较低，灭菌时间短。湿热灭菌法的使用范围比干热灭菌法广。湿热灭菌法包括高压蒸汽灭菌法、间歇灭菌法、巴斯德消毒法和煮沸消毒法。

（1）高压蒸汽灭菌法 利用高压蒸汽灭菌锅内温度高于100℃的水蒸气杀灭微生物的方法称高压蒸汽灭菌法。其原理是水的沸点随着水蒸气压力的增加而升高，加大压力是为了提高水的沸点。在密闭系统中，蒸汽压力增高，温度也随着增高，从而提高了杀菌效力。

高压蒸汽灭菌所使用的灭菌压力和时间因被灭菌的物品不同而有所差异。一般灭菌时，采用104kPa的压力（温度为121.3℃），灭菌时间为20～30min；一些耐高温：容积大的物品，压力一般为154kPa，温度为128℃，时间延长到1～2h；在高温下易破坏的物质，可采用67kPa或68kPa的压力，温度为115℃，灭菌时间为35min左右。灭菌时间是从达到要求的温度或压力时开始算起。(www.xing528.com)

影响高压蒸汽灭菌效果的主要因素有：

灭菌物体的含菌量。

1）灭菌锅内空气的排除程度。利用高压蒸汽灭菌时，必须彻底排除灭菌锅内的残余空气。

2）灭菌对象的pH值。当pH值为6.0～8.0时，微生物较不易死亡；当pH＜6.0时，最易引起微生物死亡。

3）灭菌对象的体积。在实验室内对培养基进行灭菌时，要防止用常规的压力和时间对锅内大容量培养基进行灭菌。

4）加热与散热速度。在高压蒸汽灭菌时，预热、散热的速度对灭菌效果和培养基成分都会产生影响。

高压蒸汽灭菌锅的基本操作步骤如下：

1）加水：先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。

2）放置待灭菌物品：放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意，不要将其装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。锥形瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。

3）加盖：盖上锅盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内，再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，避免漏气。

4）加热灭菌：用电炉或煤气加热，同时打开排气阀，使水沸腾，以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随着蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。

5）降温取物：在灭菌所需时间到了以后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内的温度自然下降，当压力表的压力降至0MPa时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到0MPa，则打开排气阀时，锅内压力就会突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而被污染。

6）无菌检查：将取出的灭菌培养基放入37℃的恒温箱内培养24h，经检查无杂菌生长，即可待用。

使用高压蒸汽灭菌锅时需注意：锅内的水必须是蒸馏水或纯化水；锅盖螺母必须对称拧紧；一定要在放气阀出大量蒸汽时再关闭；当灭菌结束时，必须等压力表归零后再打开；灭菌锅超过最大耐受压力后，放气阀会自动弹开，此时锅内物品不能保证灭菌完全，需重新灭菌。

（2）间歇灭菌法 间歇灭菌法是利用常压蒸汽反复几次进行灭菌的方法。该方法主要用于一些不宜进行高压灭菌的培养基的灭菌，如糖类、明胶、牛奶等。此方法是在常压下加热到100℃，维持30～60min，以杀死微生物营养体，冷却后，于适宜温度（37℃）下培养1天，次日再用同样的方法灭菌，如此反复3次，即可达到灭菌的目的。适温培养的目的是诱导未死亡的芽孢萌发成抗热性差的营养体，便于在下次灭菌时将其杀灭。其缺点是操作麻烦，时间长。

（3）巴斯德消毒法 某些物质（如牛奶、啤酒、果酒和酱油等）的营养成分在高温下易被破坏，因此巴斯德首先提出将液体物质在较低的温度下进行消毒，这样既可杀死液体中致病菌的营养体，又不破坏液体物质中原有的营养成分。典型的温度时间组合有两种：63℃30min；72℃15s。巴斯德消毒法在食品工业上常被采用。

（4）煮沸消毒法 直接将要消毒的物品放入清水中，煮沸15min，即可杀死细菌的部分营养体和部分芽孢。若在清水中加入适量碳酸钠或2%（质量分数）的苯酚，则效果更好。此方法适用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。

4.紫外线杀菌法

紫外线是一种短波光，大剂量为杀菌剂，小剂量为诱变剂。它的杀菌作用基于紫外线引起核酸形成胸腺嘧啶二聚体，从而干扰核酸的复制。此外，紫外线还可使空气中的氧变为臭氧，而臭氧不稳定，易分解，放出氧化能力强的新生态氧[O]，具有杀菌作用。紫外线的杀菌效果与波长有关，波长约为260nm的紫外线杀菌力最强。

紫外线是接种室、培养室和手术室进行空气灭菌的常用工具。市售紫外光灯有30W、20W和15W等多种规格。灭菌常选用30W的紫外光灯，菌种诱变多选用15W的紫外光灯。紫外光灯的有效作用距离为1.5～2.0m，以1m内效果为最好。使用前应搞好被照射区域的卫生，照射30min即可。紫外光灯的杀菌效果会随着照射时间的延长而降低，应适时更换。紫外光灯照射不久空气中就会产生臭氧，可根据臭氧产生的速度和强弱，粗略判断灯管的质量。有些经照射后受损害的菌体再暴露于可见光中时，会发生光复活现象。为了避免光复活现象出现，杀菌后应在黑暗中保持30min。紫外线对真菌作用的效果较差，使用时应配合其他消毒灭菌方法。

紫外线的穿透力很弱，一薄层玻璃或水都能将其大部分过滤掉。因此，紫外线只能用于物体表面消毒或空气灭菌，如对灭菌室的灭菌和一些不能用热或化学物质灭菌的器械的灭菌。紫外线对人的皮肤、眼黏膜及视神经有损伤作用，应避免直视灯管和在紫外线照射下工作。

5.过滤除菌法

过滤除菌法是指使含菌的液体或气体通过一个称为细菌滤器的装置，使杂菌受到机械的阻力作用而留在滤器或滤板上，从而达到去除杂菌的目的。凡不能耐受高温或化学药物灭菌的药液、毒素、血液等，都可采用过滤除菌法灭菌。