微生物分离、纯化和接种技术优化指南

除了要求微生物检验用的器皿和环境无菌之外，在微生物检验操作中，防止一切其他微生物侵入的无菌操作技术也十分重要。

1.操作人员无菌操作的整体要求

食品微生物实验室工作人员必须有严格的无菌观念，许多试验要求在无菌条件下进行。操作人员应穿专用试验服，戴专用试验帽和口罩，试验前先用肥皂洗手，再用酒精擦拭双手等。此外，在操作过程中要注意以下几点：

1）动作要轻，不能太快，以免搅动空气而增加污染；玻璃器皿也应轻取轻放，以免破损后污染环境。

2）操作应在近火焰区进行。

3）接种所用的吸管、平皿及培养基等必须进行消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿不能放置后再使用，金属用具应进行高压灭菌或用体积分数为95%的酒精点燃烧灼三次后使用。

4）从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位；使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。

5）使用吸管时，切勿用嘴直接吸、吹吸管，而必须用洗耳球操作。

6）观察平板时不要开盖，需蘸取菌落检查时，必须靠近火焰区操作；平皿盖也不能大开，而应上下盖适当开缝。

7）进行可疑致病菌涂片染色时，应使用夹子夹持载玻片，切勿用手直接拿载玻片，以免造成污染。用过的载玻片也应置于消毒液中浸泡消毒，然后再洗涤。

8）工作结束，收拾好工作台上的样品及器材，最后用消毒液擦拭工作台。

2.几种重要微生物无菌操作

（1）接种操作 培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针或吸管等）在无菌条件下将含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）接种于培养基或活的生物体上，这个过程叫做无菌接种操作。无菌接种操作是微生物接种技术的关键。为获得微生物的纯种培养，要求接种过程中必须严格进行无菌操作，一般要求在无菌室、超净工作台上进行。常用的接种工具有接种针、接种环、玻璃棒等。灭菌方法如图6-1-10所示。实验室常用的接种方法有斜面接种、液体接种及穿刺接种等。

图6-1-10 接种环或灭菌针的灭菌方法

空气中的杂菌在气流小的情况下，随着灰尘落下，所以接种时，打开培养皿的时间应尽量短。用于接种的器具必须经干热或火焰等灭菌。接种环的火焰灭菌方法：通常将接种环在火焰上充分烧红（接种柄一边转动一边慢慢地来回通过火焰三次），冷却，先接触一下培养基，待接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体，迅速地接种到新的培养基上，然后将接种环从柄部至环端逐渐通过火焰灭菌，复原。不要直接烧接种环，以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。平板接种时，通常先把平板的面倾斜，再把培养皿的盖打开一小部分进行接种。在向培养皿内倒培养基或接种时，试管口或瓶壁外面不要接触底皿边，试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过。

1）斜面接种

①准备工作：在待接种的斜面试管上标明待接种的菌种名称、菌株号、日期和接种者；若需贴标签，则应贴在离试管口1/3处。

②点燃酒精灯。

③将菌种试管和空白斜面试管用大拇指和其余四指握在左手中，试管底部放在手掌内并使中指位于两试管间，斜面向上呈水平状，在火焰边用右手松动试管塞以利于接种时拔出。

④右手拿接种环，通过火焰灼烧灭菌，在火焰边用右手的手掌边缘和小指、小指和无名指分别夹持棉塞将其取出，并灼烧管口。

⑤将灭菌的接种环伸入接种试管中，先将接种环接触试管内壁或未长菌的培养基，使接种环的温度冷却，然后挑取少量菌苔。将接种环退出菌种试管，迅速伸入待接种的斜面试管中，用接种环在斜面上自试管底部向上轻轻划波浪线，如图6-1-11所示。(www.xing528.com)

图6-1-11 斜面接种时的无菌操作示意图

a）接种灭菌 b）开启棉塞 c）管口灭菌 d）挑起菌苔 e）接种 f）塞好棉塞

⑥接种环退出斜面试管后，用火焰灼烧试管口，在火焰边塞好试管。接种环应逐渐接近火焰再灼烧。如果接种环上粘的菌体较多时，则应先将其在火焰边烤干，然后再灼烧，以免未烧死的菌体飞溅而污染环境。这在接种病原菌时尤为必要。

2）液体接种

①接种环、试管的灼烧灭菌与斜面接种相同。

②将沾有菌种的接种环插入液体培养基中轻轻搅拌，使菌体分散于液体中。接种后塞好棉塞，轻摇培养基使菌体均匀分布，以利于生长。

从液体培养基中接种到新鲜液体培养基中时，需用无菌的移液管或滴管。在火焰旁将移液管伸入试管内，吸取菌液，转接到待接种的培养基内，塞好棉塞，轻摇培养基使菌体均匀分布，以利于生长。

3）穿刺接种：该方法常用来接种厌氧菌、检查细菌的运动能力或用于保藏菌种。具有运动能力的细菌，经穿刺接种培养后，能沿着穿刺方向向外运动生长，故形成粗且边缘不整齐的菌生长线；不能运动的细菌仅能沿着穿刺线生长，形成细而整齐的菌生长线。

①接种前的准备工作同斜面接种。

②灼烧接种针后，用接种针挑取少量菌苔，从半固体培养基的中心垂直刺入并接近试管底部，但不要穿透，然后沿原穿刺线路将针退出，塞好试管。

③塞好棉塞，灼烧接种针。

3.常用的分离纯化技术

含有一种以上的微生物培养物称为混合培养物。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化，方法有多种。

（1）倾注平板法 首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的并且温度保持在40～50℃的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这个平板倒置在恒温箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物，如图6-1-12所示。

图6-1-12 倾注平板法及涂布平板法

（2）涂布平板法 首先把微生物悬液进行适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。

（3）平板划线法 最简单的分离微生物的方法是平板划线法。用无菌的接种环取少许培养物在平板上划线。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。平板划线法操作要点如图6-1-13所示。

图6-1-13 平板划线法操作要点