培养基和无菌器材制备技术详解

在微生物检验中，无论是检测样品中微生物的数量、种类，还是观察样品中微生物的形态、特征，都需要先选用合适的培养基对样品中的微生物进行分离、培养，才能进行后续工作。可以说，配制培养基是进行微生物检验工作的基础。

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用于培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中，微生物种类繁多，营养物质类型多样，加之试验和研究目的的不同，所以培养基的种类很多。但是，不同种类的培养基中，一般均应含有水分、碳源、氮源、无机盐、生长因子等。不同的微生物对pH值的要求不一样。例如，霉菌和酵母的培养基一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基则为中性或微碱性。所以在配制培养基时，应该根据不同微生物的要求将培养基的pH值调到合适的范围。此外，由于配制培养基的各类营养物质和容器等一般都含有各种微生物，故已配制好的培养基必须立即灭菌。如果来不及灭菌，则应暂存在冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基的酸碱度，从而带来不利影响。

1.培养基的分类

根据微生物的种类和试验目的的不同，培养基的分类方法有：按培养基的成分分为天然培养基、合成培养基、半合成培养基；按培养基的物理状态分为固体培养基、半固体培养基、液体培养基；按培养基的用途分为基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基。

2.牛肉膏蛋白胨培养基

牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，故可供微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中，牛肉膏为微生物提供碳源、能量、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时，还要加入一定量的琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下于96℃时熔化，在实际应用时，一般在沸水浴中或电炉上垫以石棉网煮沸熔化，以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。

牛肉膏蛋白胨培养基的配方为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，水1000.0mL，pH值为7.4～7.6。

3.培养基的一般配制步骤（以牛肉膏蛋白胨培养基为例）

（1）称量 按培养基配方依次准确称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻璃棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯中；也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，取出称量纸即可。

注意：蛋白胨易受潮，在称取时动作要迅速；称药品时严防药品混杂，称取一种药品后，将药匙洗净擦干后再称取另一种药品，或一把药匙称取一种药品；药品的瓶盖不要盖错。

（2）熔化 在上述烧杯中先加入少量水，用玻璃棒搅匀，然后在石棉网上加热使其溶解，或在磁力搅拌器上加热使其溶解。将药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已熔化的药品中，再加热熔化，最后补足所损失的水分。当用锥形瓶盛固体培养基时，一般也可将一定量的液体培养基分装于锥形瓶中，然后按1.5%～2.0%（质量分数）的量将琼脂直接加入各锥形瓶中，不必加热熔化，在灭菌时使加热与熔化同步进行，节省时间。

注意：在溶解琼脂时，要小心控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器，并需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦；配制培养基时，不可用铜或铁锅加热熔化，以免离子进入培养基中，影响细菌生长。

（3）调pH值 在未调pH值前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值。如果偏酸，则用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L的NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH值达7.6；反之，用1mol/L的HCl逐滴加入进行调节。对于某些要求pH值较精确的微生物，可用酸度计进行pH值的调节。

注意：调节pH值时不要过度，因回调会影响培养基内各离子的浓度。配制pH值低的琼脂培养基时，若预先调好pH值并在高压蒸汽下灭菌，则琼脂会因水解而不能凝固。因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性条件下灭菌，然后再调整pH值。

（4）过滤 趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利于对某些试验结果的观察。一般在无特殊要求的情况下，这一步可以省略。

4.培养基的分装

按试验要求，可将配制的培养基分装于试管或锥形瓶内，然后进行必要的包扎，以便进行灭菌处理。

（1）试管的分装 按图6-1-4所示，将培养基分装到洁净的试管中。

注意：在分装过程中，不要将培养基粘在管中和试管上段，以免引起污染；固体或半固体培养基要在琼脂完全溶化时趁热分装。

分装量：液体培养基高度以试管高度的1/4左右为宜；固体培养基分装试管，其分装量不超过管高度的1/5，灭菌后制成斜面；半固体培养基分装试管，一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝固。

图6-1-4 培养基的分装装置

（2）锥形瓶的分装 分装锥形瓶的量则根据需要而定，一般以不超过锥形瓶容积的1/2为宜，如果用于振荡培养，则根据通气量的要求酌情减少。有的液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分（如抗生素），因此分装量一定要准确。

5.包扎

（1）棉塞的制作 制作棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的圆孔上，用右手食指将棉花从中央压入圆孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。棉塞的制作步骤如图6-1-5所示。棉塞大小、松紧要适宜，塞好后应紧贴试管壁而不留空隙，起到通气和过滤空气中杂菌的作用。棉塞的1/3在管外，2/3在管内，以手提棉塞试管不下落为准，具体如图6-1-6所示。

图6-1-5 棉塞的制作步骤

（2）试管及锥形瓶的包扎 在培养基分装完毕后，在试管口或锥形瓶上塞好棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内造成污染，并保证有良好的通气性能。加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，最后用麻绳扎好。用记号笔注明培养基的名称、配制日期、组别，准备灭菌。

图6-1-6 棉塞做法

1—正确 2—管内太短，外部太松 3—整个棉塞太松 4—管内太紧，外部太松(www.xing528.com)

试管可加棉塞、塑料试管帽或硅胶试管塞封口。锥形瓶的棉塞外通常包一层纱布，根据需要也可用8层纱布或封口膜包在瓶口上。封口后外面再包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。用麻绳以活结的形式扎好，使用时容易解开。

（3）培养皿的包扎 培养皿由一盖一底组成一套，常用报纸包装，一般以5～10套为宜，或者装在金属平皿筒内，加盖灭菌。包装后的培养皿必须经灭菌之后才能使用。

（4）移液管的包扎 在移液管顶端塞一小段棉花，以免使用时将杂菌吹入管中或将微生物吸出管外。将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的近右端，与纸条约成45°角，并利用余下的一段纸条将吸管卷好，如图6-1-7所示。按此方法包好的吸管可单独灭菌，也可集中用报纸扎成捆后进行干热或湿热灭菌。

图6-1-7 吸管的包扎流程

6.灭菌

培养基在分装包扎后应立即进行高压蒸汽灭菌，一般可采用0.103MPa，121℃，20min的高压蒸汽灭菌。玻璃器皿既可进行高压蒸汽灭菌，也可进行干热灭菌。

7.摆斜面

将灭菌的试管培养基冷却至50℃左右，将试管口一端倾斜搁在玻璃棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长度的1/2为宜，如图6-1-8所示。

图6-1-8 斜面的放置示意图

8.倒平板

将装在锥形瓶或已灭菌的琼脂培养基溶化后，冷却至50℃左右倾入无菌培养皿中。若温度过高，则皿盖上的冷凝水太多；若温度低于50℃，则培养基易于凝固而无法制作平板。

无菌操作倒平板培养基的方法有持皿法和叠皿法两种，如图6-1-9所示。

图6-1-9 倒平板

a）叠皿法 b）持皿法

（1）持皿法

1）将若干无菌培养皿叠放在左侧，便于拿取。

2）点燃煤气灯，将火焰调到适中（空气不要太大，以免气流过急）。

3）倒平板时，先用左手握住锥形瓶的底部，倾斜锥形瓶，用右手旋松棉塞，然后用右手的小指和手掌边缘夹住棉塞并将它拔出（切勿将棉塞放在桌面上），随之将瓶口周缘在火焰上过一下（不可灼烧，以防爆裂，以杀死可能粘在瓶口外的杂菌），然后将锥形瓶从左手传至右手中（用右手的拇指、食指和中指拿住锥形瓶的底部），在这个操作过程中瓶口应保持在离火焰2～3cm处，并始终向着火焰。左手拿起一套培养皿，用中指、无名指和小指托住培养皿底部，用食指和大拇指夹住皿盖并开启一条缝，恰好能让锥形瓶伸入，随后倒出培养基。一般约倒入12mL的培养基即可铺满整个皿底。盖上皿盖，置于水平位置等凝。然后再将锥形瓶移至左手，瓶口再次过火并塞紧棉塞。

平板培养基的冷凝方法有两种：一种是将平板一个个地摊开在桌面上冷凝，另一种是将几个平板叠在一起冷凝。前者冷凝速度较快，在室温较高时采用；后者冷凝速度较慢，可在室温较低时采用，其优点是形成冷凝水少，尤其适用于平板划线。

（2）叠皿法 此方法步骤与持皿法基本相同。不同点是左手不必持培养皿，而是将培养皿叠放在煤气灯的左侧并靠近火焰，用右手拿住锥形瓶的底部，左手的掌背对着瓶口，用小指与无名指夹住瓶塞，将其拔出，随即使瓶口过火，同时用左手开启最上面的皿盖，倒入培养基，盖上皿盖即移至水平位置待凝，再依次倒下面的平板。在操作过程中，瓶口应向着火焰保持倾斜状，以防空气中微生物的污染。

9.无菌检查

将灭菌培养基于37℃保温24～48h，以检查灭菌是否彻底。配制培养基时的注意事项如下：

1）建立完善的配制记录。制备培养基时，将培养基制备日期、种类（型）、名称、配方、原料、灭菌的压力和时间、最终pH值和制备者等进行详细记录，以防发生混乱。

2）合理存放培养基。培养基最好现配现用，若制作好的培养基当时不用，则应存放于冷暗处，最好放于普通冰箱内，放置时间不应超过1周，以免降低其营养价值或发生化学变化。

3）分装培养基时必须进行严格的无菌操作。在灭好菌备用的培养基再分装的过程中，制平板、斜面等时必须进行严格的无菌操作。

4）高压灭菌时，灭菌锅升压前只有排尽锅内的冷空气，才能达到最终灭菌效果。灭菌完成后不宜一次将气排除，应缓慢多次放气或自然冷却降温后再打开灭菌锅。