微生物染色技术及其影响因素

细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使染色的菌体与背景形成明显的色差，从而能清楚地观察到其形态和构造。微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。

微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上的特性，根据微生物在形态结构上的不同，达到区别、鉴定微生物的目的。

1.简单染色法

细菌的简单染色是指用单一染料处理菌体。该方法操作简便，易于掌握，适用于细菌一般形态的观察。

实验室常用碱性染料进行简单染色。这是因为细菌在中性环境中一般带负电荷，而碱性染料在电离时，染料离子带正电荷，故碱性染料的染色部分很容易与细菌结合而使细菌着色。染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用的碱性染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。

当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。

2.革兰氏染色法

革兰氏染色法是细菌学中重要的鉴别染色法。该染色法是在1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的，此后一些学者在此基础上做了某些改进。

革兰氏染色法是先将细菌用初染液（草酸铵结晶紫）染色，加媒染剂（革兰氏碘液）媒染后，用脱色剂（体积分数为95%的乙醇）脱色，再用复染剂（沙黄或番红染液）染色。根据此染色反应结果，可将所有细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两大类。呈蓝紫色的为革兰氏阳性细菌，以G⁺表示；呈红色的为革兰氏阴性细菌，以G^-表示。

细菌在革兰氏染色中的呈色差异是由两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。在用草酸铵结晶紫初染后，所有细菌都被染成蓝紫色。碘作为媒染剂，可增加染料和细胞的亲和力，与结晶紫结合形成结晶紫-碘复合物。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果不同。当革兰氏阳性细菌染色时，结晶紫-碘复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色；而革兰氏阴性细菌则不同，结晶紫-碘复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。这是由于G⁺细菌的细胞壁较厚，肽聚糖含量较高，网格结构紧密，含脂量又低，当它们被乙醇脱色时，肽聚糖网孔由于缩水会明显收缩，从而阻止结晶紫-碘复合物的逸出，故菌体呈深紫色；G^-细菌的细胞壁薄，肽聚糖含量低，且网格结构疏松，故遇乙醇后，其网孔不易收缩，加上G^-细菌的脂类含量高，当乙醇脱色时，脂类物质溶解，细胞壁透性增大，因此，结晶紫-碘的复合物就容易被浸出，故菌体呈红色。

3.细菌染色的基本步骤

（1）细菌涂片的制作

1）涂片：用接种环从试管培养液中取一环菌，在载玻片中央涂成薄层即可；或先滴一小滴无菌水于载玻片中央，用接种环从斜面挑出少许菌体，与载玻片上的水滴混合均匀，涂成一薄层，一般涂布直径以1cm为宜。

2）干燥：涂片后可自然干燥，也可在酒精灯上略加热，使之迅速干燥。

3）固定：固定的方法主要取决于用什么染色法，常用的有火焰固定法和化学固定法。火焰固定法的主要操作要领是：手持载玻片一端，使涂片面向上，于火焰上通过两三次，使细胞质凝固（以固定细菌的形态），并使其牢固地附在载玻片上，不易脱落，如图6-1-1所示。

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图6-1-1 细菌涂片的制作

（2）简单染色法

1）染色：滴加美蓝液（或其他染液）覆盖载玻片涂菌部位，染色时间根据具体染色液而定。吕氏碱性美蓝染色液染2～3min，苯酚复红染色液染1～2min。

2）水洗：夹住载玻片一端，斜置，用细小的水流由上至下将多余的染液冲洗掉，直到流下的水为无色为止。

3）干燥：自然风干，或用吸水纸吸去水分，或微微加热，以加快干燥。

4）镜检：待涂片完全干燥后用油镜观察。

（3）革兰氏染色法

1）初染：用草酸铵结晶紫染色1～2min，水洗。

2）媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。

3）脱色：用滤纸吸去载玻片上残留的水分，将载玻片倾斜，在白色背景下，用滴管连续滴加体积分数为95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色为止，时间为20～30s，然后立即水洗并吸干水分。

4）复染：用番红复染约2min，水洗。

5）镜检：干燥后用油镜观察，革兰氏阳性细菌呈蓝紫色，革兰氏阴性细菌呈红色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌常由于脱色不完全而呈假阳性。

注意：脱色是革兰氏染色关键的一步，可直接用体积分数为95%的酒精冲洗脱色，直到流下的酒精接近无色为止，然后立即用水冲洗，以避免脱色时间过长而影响最终染色结果。另外，挑菌量、固定温度、染色时间也是影响染色结果的重要因素。只有通过反复实践，才能获得满意的试验结果。

革兰氏染色的基本步骤如图6-1-2所示。