薄层色谱法（TLC）是将适宜的固定相均匀地涂布于具有光洁表面的玻璃、塑料或金属板上，形成薄层，然后在此薄板上进行色谱分离的方法。薄层色谱法属于固-液吸附色谱法。与高效液相色谱法不同，薄层色谱法将固定相涂布在载板上，使之形成均匀的薄层。被分离的样品溶液点加在薄层板下沿，再把下沿向下放入盛有流动相的密闭缸中，进行色谱展开，实现混合组分的分离。被展开的组分斑点即为色谱谱带。通过适当的技术对色谱谱带进行处理，即可得到定性和定量的检测结果。
薄层色谱法具有技术比较简单、操作容易、分析速度快、高分辨能力、结果直观、不需昂贵的仪器设备就可以分离较复杂混合物等特点。
薄层色谱法按分离机制主要分为吸附薄层色谱法、分配薄层色谱法和分子排阻色谱法。下面以吸附薄层色谱为例，介绍其分离的基本原理。
1.吸附薄层色谱的分离原理
（1）基本原理 固定相为吸附剂的薄层色谱法又称为吸附薄层色谱分离法。它利用各成分对同一吸附剂吸附能力的不同，使移动相（溶剂）流过固定相（吸附剂）的过程中，连续地产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而达到各成分互相分离的目的。
薄层层析可根据作为固定相的支持物不同，分为薄层吸附层析（吸附剂）、薄层分配层析（纤维素）、薄层离子交换层析（离子交换剂）、薄层凝胶层析（分子筛凝胶）等。一般试验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。
例如，用硅胶和氧化铝作支持剂，其主要原理是吸附力与分配系数的不同而使混合物得以分离。溶剂沿着吸附剂移动时，带着样品中的各组分一起移动，同时发生连续吸附与解吸作用以及反复分配作用。由于各组分在溶剂中的溶解度不同，以及吸附剂对它们的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列斑点。若作为标准的化合物在层析薄板上一起展开，则可以根据这些已知化合物的比移值（Rf值，见图5-6-1）对各斑点的组分进行鉴定，同时也可以进一步采用某些方法加以定量。
图5-6-1 薄层展开和Rf值示意图
（2）比移值 在薄层色谱法中，比移值Rf是指从基线至展开斑点中心的距离与从基线至展开剂前沿的距离的比值。
比移值描述组分斑点的位置，是薄层色谱的基本定性参数。在一定的色谱条件下，特定化合物的Rf值是一个常数，因此有可能根据化合物的Rf值鉴定化合物。在实践中，Rf值的可用范围为0.2～0.8，最佳范围为0.3～0.5。
影响比移值的因素主要有被分离物质的结构和性质、平面的性质、展开剂的性质和温度、展开剂蒸气的饱和程度。
（3）分离度（R） 两相邻斑点中心距离与两斑点平均宽度（直径）的比值称为分离度或分辨率，即
式中 d——两相邻斑点中心距离；
W1——斑点1的宽度；
W2——斑点2的宽度。
2.仪器与材料
（1）薄层板
1）玻璃板：除另有规定外，用5cm×20cm，10cm×20cm或20cm×20cm的规格，要求光滑、平整、洗净、晾干，不附水珠。
2）固定相或载体：最常用的有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254，其次有硅藻土、氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、微晶纤维素F254等。其颗粒大小，一般要求直径为10～40μm。薄层涂布，一般可分无黏合剂和含黏合剂两种。前者是将固定相直接涂布于玻璃板上；后者是在固定相中加入一定量的黏合剂，一般常用质量分数为10%～15%的煅石膏（CaSO4·2H2O在140℃加热4h）混匀后加适量水，或用质量分数为0.2%～0.7%的羧甲基纤维素钠水溶液适量调成糊状，均匀涂布于玻璃板上。也有含一定展开液或缓冲液的薄层。
（2）涂布器 应能使固定相或载体在玻璃板上涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。
（3）点样器 常用具有支架的微量注射器或毛细管，应能使点样位置正确、集中。
（4）展开容器 应使用适合薄层板大小的玻璃制薄层色谱展开缸，并有严密的盖子，除另有规定外，底部应平整光滑，或有双槽，应便于观察。
（5）展开剂
1）对展开剂选择的基本考虑。薄层展开剂的选择对分离的影响很大。与高效液相色谱法同理，对复杂样品的分离能否得到理想的结果，展开剂的选择是最重要的因素之一。不同的溶质与流动相分子、固定相分子间的作用力不同，因此其移动速度也不同，最终导致样品中各组分的分离。选择流动相时不仅需考虑极性、选择性等因素，更基本的应注意以下因素的影响：
①溶剂纯度，杂质会影响分离。
②溶剂吸收环境水分，会使极性等性质改变。
③存放条件不适宜或储存时间过长，会使溶剂变性。
④混合流动相之间发生作用会使溶剂性质改变。溶剂极易挥发，流动相组成随时改变。
2）几种常用薄层色谱分离模式的展开机制
①液固吸附展开。在薄层色谱法分离中，液固展开是一种最经典的展开方式。液固展开时常将极性吸附硅胶、氧化铝作固定相。流动相依其极性可在吸附剂表面形成单分子或双分子溶剂吸附层。在展开过程中，组分的保留及分离选择性主要由以下三种因素决定：
a.溶剂对样品的溶解能力。
b.溶质和流动相分子对固定相表面活性吸附位点的竞争。
c.溶质分子与吸附剂表面上吸附中心间的特殊作用力。(www.xing528.com)
②液液分配展开。与液液分配柱色谱分配机理相同，组分在互不相溶的两液相中的溶解度不同，因此迁移速率存在差异，从而在迁移过程中得到分离。
除以上两种展开机制外，还有化学键合相展开和离子交换展开。
（6）显色剂 显色剂可以分为两大类：一类是用于检查一般有机化合物的通用显色剂；另一类是根据化合物分类或特殊官能团设计的专属性显色剂。
3.薄层色谱法中薄层板的制备、点样、展开和斑点的检出
（1）薄层板的制备 涂板方法可以分为涂布法、倾注法、喷洒法及浸渍法四类。其中，涂布法是应用最广泛的涂板方法。
薄层色谱法中固定相薄层涂布大多采用湿法匀浆，要求薄层均匀、平整、无气泡、不易造成凹坑和龟裂。
薄层板活化处理可以获得适宜活性，提高色谱分离效率和选择性。也可直接购买性质相当的市售薄层板。目前，市售薄层板分为普通薄层板和高效薄层板，主要有硅胶薄层板、硅胶GF254薄层板、聚酰胺薄膜和铝基片薄层板。
（2）点样 用微量进样器进行点样。点样前，先用铅笔在层析上距末端1cm处轻轻画一横线，然后用毛细管吸取样液在横线上轻轻点样。如果要重新点样，一定要等前一次点样残余的溶剂挥发后再点样，以免点样斑点过大。一般斑点直径大于2mm，不宜超过5mm。底线距基线1～2.5cm，点间距离为1cm左右，样点与玻璃边缘的距离至少为1cm。为防止边缘效应，可先将薄层板两边刮去1～2cm，再进行点样。
（3）展开 薄层色谱法展开就是流动相沿薄层（固定相）运动，以实现样品混合组分分离的过程。这一过程需在具有一定形状的展开室中进行。薄层展开有三种形式，其中直线式展开方式为实际应用中使用最普遍的展开方式。
1）展开室应预饱和。为达到饱和效果，可在室中加入足够量的展开剂；或者在壁上贴两条与室一样高和一样宽的滤纸条，一端浸入展开剂中，密封室顶的盖。
2）展开剂一般为两种以上互溶的有机溶剂，并且临用时现配为宜。
3）薄层板点样后，应待溶剂挥发完，再放入展开室中展开。
4）展开应密闭，展距一般为8～15cm。薄层板放入展开室时，展开剂不能没过样点。一般情况下，展开剂浸入薄层下端的高度不宜超过0.5cm。
5）展开剂每次展开后，都需要更换，不能重复使用。
6）展开后的薄层板应使用适当的方法使溶剂挥发完全，然后进行检视。
7）Rf值一般控制在0.3～0.8。当Rf值很大时，应适当改变流动相的比例。
（4）斑点的检出 展开后的薄层板经过干燥后，常通过紫外光灯照射或用显色剂显色来检出斑点。对于无色组分，当使用显色剂时，显色剂喷洒要均匀，量要适度。紫外光灯的功率越大，暗室越暗，检出效果就越好。
4.薄层色谱定性、定量方法
（1）斑点定位 斑点定位必须采用非破坏性方法。当斑点紫外光显示时，可采用长波长和短波长的紫外光灯，方便、灵活。当采用化学试剂显色时，通过手动或电动喷雾器向展开好的薄层板喷洒显色试剂。
（2）定性方法
1）利用保留值定性。在特定的色谱系统中，化合物的Rf值一定，比较未知物和标准物的Rf值，能够作为鉴定未知物的依据。Rf值的准确测定受多方面因素的影响。为了增加Rf值定性的可靠性，必须改变色谱系统的选择性，重复测定同一化合物的Rf值。如果在分离机理不同的色谱体系中比较Rf值仍能得到肯定的结果，那么其可靠性将更大。
2）板上化学反应定性。板上化学反应定性主要有以下两种方式：
①反应后生成特征颜色的化合物，借以鉴定反应物。
②反应后生成复杂的、无法鉴定组分的混合物，但可根据生成物的“指纹”特征加以鉴定。
③除以上两种定性反应方法外，还有板上光谱定性、薄层色谱法与其他技术间接联用定性、薄层色谱-傅里叶变换红外光谱联用定性以及薄层色谱-质谱联用定性。
（3）定量方法
1）间接定量法。间接定量法就是将薄层色谱法已分离的物质斑点洗脱下来，再采用其他方法对该洗脱液进行定量分析。薄层色谱法间接定量的关键是斑点组分的定量洗脱。选用怎样的洗脱方法，取决于组分和薄层吸附剂的性质。用来洗脱组分斑点的溶剂对下一步定量方法应无影响。
①分光光度法：将洗脱液配制成标准体积，在同样条件下对样品和标准液进行吸光值测量。
②高效液相色谱法：以薄层色谱法斑点洗脱液直接进行高效液相色谱分离和定量。
③气相色谱法：以薄层色谱法斑点洗脱液直接进行气相色谱分离和定量。
④质谱法：采用组分质谱图中的特征离子峰进行定量。
2）直接定量法
①斑点面积测量法：以半透明纸扫下薄层色谱图上的斑点界限，然后测量其面积。将斑点面与同平行操作的标准样面积相比较进行定量。
②目测法：将被测样品和系列溶液点在同一薄层板上，展开后用适当的方法显色，可以得到系列斑点，然后将被测样品的斑点面积和颜色与标准系列的斑点相比较，可推测出样品的含量范围。这种定量法非常适用于对常规大量样品的重复分析。
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