高效液相色谱仪的往复式柱塞泵及色谱柱优化技术

1.仪器结构及工作流程

高效液相色谱仪的基本结构一般包括储液器、高压输液泵、梯度洗脱装置、进样器、色谱柱、检测器以及数据处理系统等，如图5-5-2所示。高效液相色谱仪的工作流程为：流动相经过滤后由高压输液泵输送到色谱柱入口（若采用梯度洗脱方式，常需双泵系统完成流动相的输送），样品由进样器自进样口注入后随着流动相流经色谱柱完成组分分离，分离后的组分随着流动相离开色谱柱进入检测器，检测器将检测到的信号输给数据处理装置。若需收集馏分作进一步分析，则可在色谱柱出口一侧收集馏分。

（1）储液器 储液器用来供给足够数量、符合要求的流动相，以完成分离、分析任务。对储液器的要求为：应有足够的容积，确保重复测定时的供液；便于脱气；能耐一定压力；所选用的材质对所储溶剂都是化学惰性的。

储液器一般为不锈钢或玻璃的，容积一般为0.5～2L。流动相用前必须脱气，因为色谱柱是带压操作，而检测器是常压操作。若流动相中所含气体不排除，则流入色谱柱时会因受压而压缩，流出色谱柱进入检测器时会因常压而溢出，从而造成检测器噪声增大，基线不稳，仪器工作不正常。这在梯度洗脱时尤显重要。

常用的脱气方法有低压脱气法、吹氦脱气法、超声波脱气法。

（2）高压输液泵

1）要求：高压输液泵是高效液相色谱仪的重要部件之一，因此，要求其流量稳定、精度高（以保证重复测定结果的重现性和定性定量的精度），输出压力高且平稳，无脉动，流量范围宽，最高压力可达30～60MPa，耐腐蚀，压力波动小（减少噪声），死体积小，易于清洗和更换溶剂，适于梯度洗脱。

2）类型：常用于高效液相色谱仪的高压泵按输液性能分为两类：恒压泵（如气动放大泵）和恒流泵（如往复式柱塞泵）；按机械结构又分为往复式柱塞泵和气动放大泵等。往复式柱塞泵是目前高效液相色谱仪使用最为广泛的一种泵，其结构如图5-5-3所示。由于泵的柱塞往复运动频率较高，对密封环的耐磨性、单向阀的刚性及精度要求都很高。密封环采用聚四氟乙烯添加剂材料，单向阀的球、阀座及柱塞采用人造宝石材料。往复泵分为单柱塞、双柱塞及三柱塞三种，柱塞越多，则流量越平衡，脉动越小。气动放大泵主要用于装柱。

（3）梯度洗脱装置 梯度洗脱时由两种或两种以上不同极性的溶剂作流动相，在分离过程中按一定程序连续、适时地改变流动相的极性配比，以改变欲分离组分的分离状况。梯度洗脱方式可以提高色谱柱的分离度，缩短分析周期等。这种方式使复杂混合物的分离变得更容易。

图5-5-3 往复式柱塞泵结构

梯度洗脱分为高压梯度洗脱（又称为内梯度洗脱）和低压梯度洗脱（又称为外梯度洗脱）。低压梯度洗脱时，在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱系统，也称为泵前混合。高压梯度洗脱时，用泵（通常要两台泵）将溶剂预先加压，然后输入色谱系统的梯度混合室，混合后再送入色谱柱，也称为泵后（高压）混合。

（4）进样器 进样器是将样品引入色谱柱的装置。对于液相色谱而言，要求其重复性要好，死体积要小，以保证柱中心进样。进样时色谱柱系统流量波动要小，以便于自动化等。进样包括取样（准备）和进样（工作）两个环节。对于高效液相色谱法而言，进样方式和进样体积对柱效能的影响是很大的。要获得良好的分离效果及重现性，需要将样品浓缩后瞬时注入色谱柱上端柱担体的中心并成一小点。若将样品注入色谱柱担体前的流动相溶剂中，通常会使溶质以扩散的形式进入色谱柱顶端，易导致样品组分分离效能下降。目前符合要求的进样方式主要有：

1）注射器进样：用微量注射器将样品注入与色谱柱相连的进样系统内。这种进样方式可以获得比其他任何一种进样方式都要高的柱效能，且价廉、易于操作，但不宜采取带压进样，且峰形重现性也不太理想。

2）六通进样阀：借助于高压定量进样阀（常为六通阀，见图5-5-4）直接向压力系统进样。常用的定量进样阀为定体积进样阀，可以在高压下将样品送入色谱柱，不需停流，进样量由固定体积（通常为10μL和20μL）的定量管控制，所以重复性好。

图5-5-4 六通进样阀

a）准备 b）工作

3）自动进样器：在程序控制器或计算机控制下，自动完成取样、进样、清洗等一系列操作的一种进样方式。操作者只需将样品按顺序装入储样装置，即可连续调节进样量，重复性高。

（5）色谱柱 色谱柱是高效液相色谱仪的核心部件，具有分离作用。柱效能高、选择性好、分析速度快是对色谱柱的一般要求。在日常分析中，高效液相色谱法普遍采用微粒高效固定相，常用的分析柱是内径为4.6mm、长度为10～30cm的直形不锈钢柱，并且柱内壁是经过严格抛光的。为使色谱柱达到应有的柱效能，除了系统的死体积要小之外，还需要合理的柱结构以及装柱方法和技术。

此外，高效液相色谱仪常用的色谱柱恒温装置有水浴式、电加热式、恒温箱式三种。用于液相色谱柱恒温装置的最高温度不应超过100℃，否则流动相汽化会使分析工作无法进行。

（6）检测器 理想的液相色谱检测器应具备灵敏度高、重现性好、响应速度快、线性范围宽、通用性强、对流动相流速及温度变化不敏感、死体积小的特点。几种主要的常用液相色谱检测器的基本特性见表5-5-1。

表5-5-1 几种主要的常用液相色谱检测器的基本特性

1）紫外光度检测器。这是一种使用最早且应用最广泛的检测器之一。这种检测器不仅有较高的灵敏度和选择性，而且对环境温度、流动相组成及流速的变化不敏感，因此，无论等度洗脱或梯度洗脱都适用。

这种检测器基于欲测组分（在流通池中）对特定波长的紫外光产生选择性吸收，对于单色光，组分浓度与吸光度之间服从吸收定律。(www.xing528.com)

紫外光度检测器有固定波长（单波长和多波长）及可变波长（紫外分光和紫外可见分光）两类。检测波长一般固定在紫外光区中的254nm和280nm。由于这种检测器的检测灵敏度很高，因此对于一些吸收较弱的物质，也可以实现检测。但这种检测器对流动相溶剂的选用有一定限制。各种溶剂均有其一定的可透过波长下限值，超过这一数值时，溶剂的吸收会变得很强，以致检测不出待测组分的吸收值。高效液相色谱法常用部分溶剂透过波长的下限值见表5-5-2。下限值是指溶剂在以空气为参考，流动池光程长为1cm时，恰好产生1.0个吸光度时相应的波长（nm），即在溶剂透射率为10%时所对应的波长值。

表5-5-2 高效液相色谱法常用部分溶剂透过波长的下限值 （单位：nm）

（续）

将二极管阵列作为检测元件用于紫外光度检测器是一大进展。阵列由光电二极管组成，每个二极管宽50μm，各自完成一窄段的光谱测量。当光源发出的紫外光或可见光通过样品流通池时，被流动相中的样品组分选择性吸收，再进入单色器分光后照射在二极管阵列装置上，这样就同时获得各波长的信号强度，并用电子学方法以及计算机技术对二极管阵列快速扫描采集数据。由于扫描速度极快，远远超出色谱流出峰的速度，因此可无需停留扫描而观察色谱柱流出物各个瞬间的动态光谱吸收图，经计算机处理后可获得三维色谱-光谱图，如图5-5-5所示。因此，可利用色谱保留值规律及光谱特征吸收曲线综合进行定性分析。同时，还可以对每个色谱峰的指定位置（峰的前沿、顶点、峰的后沿）实时记录吸收光谱图并进行比对，从而判断色谱峰的纯度以及分离状况。

图5-5-5 三维色谱-光谱图

2）示差折光检测器（RI）。示差折光检测器又称为光折射检测器。这种检测器是借助于连续测定色谱柱流出物光折射率的变化而实现对样品浓度测定的。溶液的折射率是纯溶剂（流动相）和纯溶质（样品）各自折光射率乘以各自浓度的和。溶有样品的流动相和流动相本身的光折射率之差即表示样品在流动相中的浓度。原则上凡是与流动相光折射指数有差别的样品都可用该方法测定，所以它是一种通用型的浓度检测器。该方法的检测下限可达10^-6～10^-7g/mL。常用溶剂在20℃时的光折射率见表5-5-3。按检测原理的不同，示差折光检测器可分为偏转式和反射式两种类型。通常高效液相色谱法均使用反射式示差折光器，可以获得较高的检测灵敏度。但该检测器不适于梯度洗脱。

表5-5-3 常用溶剂在20℃时的光折射率

3）荧光检测器。这是一种很灵敏且选择性好的检测器。许多化合物，特别是具有对称共轭结构的有机芳香族化合物和生化物质被入射的紫外光照射之后，能吸收其中一定波长的光，使原子中的某些电子从基态中的最低振动能级跃迁到较高电子能级的某些振动能级。之后，由于电子在分子中的碰撞，消耗一定的能量，而下降到第一电子能级的最低振动能级，再跃迁至基态电子能级中的某些不同振动能级，同时发射出比原来所吸收的频率较低、波长较长的光，即荧光。被这些物质所吸收的光叫做激发光，产生的荧光叫做发射光。荧光的强度与入射光强、量子效率以及样品浓度有正比关系。

荧光检测器最大的优点是具有极高的灵敏度（比紫外光度检测器高1～3个数量级，达μg/L级）及良好的选择性，样品用量少，适于药物及生化分析，线性范围仅约为10³。

（7）色谱工作站 目前高效液相色谱仪广泛使用色谱工作站，用途包括：采集、处理和分析数据；控制仪器；色谱系统优化和专家系统，可使所有分析过程均可在线模拟显示，进行数据自动采集、处理和存储，并对整个分析过程实现自动控制。要能准确、快速和有效地分析实际样品，必须建立色谱分析法，首先应选择合适的柱分离模式；其次选择流动相，可以通过调节流动相的配比及组成达到分离选择性的优化，同时还可对柱长、固定相粒度以及流动相流速等参数进行最优化，最终还要验证方法的正确性。

2.固定相与流动相

（1）固定相 液-固吸附色谱常用的固定相有硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等全多孔型或薄壳型的固体吸附剂。

在液-液色谱固定相中，固定液的种类相对比较少。原则上讲，凡气-液色谱可以使用的固定液，只要不与流动相互溶，就可用在液-液色谱中。但与气相色谱不同，液相色谱的流动相参与分离过程，因此可用于液-液色谱的固定液就只有极性不同的几种。

化学键合型固定相就是将有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶表面的游离羟基上而形成的固定相。这类固定相的突出特点是兼有吸附和液-液分配机制，耐溶剂冲洗，较一般液体固定相传质快，利于梯度洗脱，并且可以通过改变键合相有机官能团的类型来改变分离的选择性。按键合官能团的极性，键合相可分为极性键合相和非极性键合相两种。目前使用最广泛的是非极性烷基键合相，特别是C18反相键合相（简称为ODS）在反相色谱中发挥着重要作用。

离子交换色谱固定相就是离子交换树脂，有两种类型：薄膜型离子交换树脂和离子交换键合固定相。这两类离子交换树脂又可分为阴离子交换树脂和阳离子交换树脂两种类型，按离子交换功能团酸碱性及其强弱可分为强酸性、强碱性、弱酸性、弱碱性四种类型。其中，强酸性和强碱性离子交换树脂的稳定性相对更好一些，pH值适用范围也比较宽，因此在高效液相色谱中的使用也更广泛一些。

凝胶是空间排阻色谱用固定相，是含有大量液体（通常为水）的柔软并富有弹性的物质，是一种经过交联而具有立体多孔网状结构的多聚体，分为软质、半硬质和硬质三种类型。软质凝胶适用于以水为流动相的凝胶过滤色谱；半硬质凝胶是目前应用最多的凝胶，适用于非极性有机溶剂；硬质凝胶具有化学稳定性和对热稳定性，机械强度高，可在色谱柱中直接更换溶剂，是目前用得较多的无机凝胶。

（2）流动相 理想的液相色谱流动相应当具有黏度低，与检测器兼容性好，易于纯化和毒性低等特征。高效液相色谱法常采用多元溶剂系统，根据各自在组合溶剂系统中所起作用的不同分为洗脱剂和调节剂。前者决定基本的分离，后者调节样品组分的滞留并对某几个组分具有选择性的分离作用。在正相色谱中，洗脱剂采用低极性的溶剂（如正己烷、苯、氯仿等），而调节剂则根据样品组分的性质选择极性较强的针对性溶剂（如醚、酯、酮、醇、酸等）。在反相色谱中常以水为流动相的主体，将加入不同配比的能与水互溶的极性有机溶剂（如甲醇、乙腈、四氢呋喃等）作为调节剂。甲醇与水的混合流动相足以满足多数样品的分离要求，且黏度小，毒性比乙腈小，价格低廉，是反相色谱法中常用的流动相。但乙腈的溶剂强度较高且黏度较小，并满足在紫外光区185～205nm处的检测要求。综合来看，乙腈-水系统要优于甲醇-水系统。

在化学键合相色谱法中，溶剂的洗脱能力直接与它的极性相关。在正相色谱中，溶剂的强度随着极性的增强而增加；在反相色谱中，溶剂的强度随着极性的增强而减弱。常用溶剂的极性由大至小的顺序为：水＞甲酰胺＞乙腈＞甲醇＞乙醇＞丙醇＞丙酮＞二氧六环＞四氢呋喃＞甲乙酮＞正丁醇＞乙酸乙酯＞乙醚＞异丙醚＞二氯甲烷＞氯仿＞溴乙烷＞苯＞氯丙烷＞甲苯＞四氯化碳＞二硫化碳＞环己烷＞己烷＞庚烷＞煤油。

离子交换色谱主要在含水介质中进行。组分的保留值可用流动相中离子强度以及介质酸碱度进行控制，增加离子强度可使保留值降低。对于阳离子交换柱：随着流动相pH值的增加，保留值减小。对于阴离子交换柱：随着流动相pH值的增加，保留值增加。流动相中的离子类型对样品组分的保留值有显著影响。通常阴离子的保留顺序由大至小为：C₆H₅O₇^3-＞SO₄^2-＞I^-＞NO₃^-＞CrO^2-₄＞Br^-＞SCN^-＞Cl^-＞HCOO^-＞CH₃COO^-＞OH^-＞F^-。阳离子的保留顺序由大至小大为：Ba²⁺＞Pb²⁺＞Ca²⁺＞Ni²⁺＞Cd²⁺＞Cu²⁺＞Co²⁺＞Zn²⁺＞Mg²⁺＞Ag⁺＞Cs⁺＞Rb⁺＞K⁺＞NH₄⁺＞Na⁺＞H⁺＞Li⁺，但彼此差别不如阴离子明显。

空间排阻色谱法所用流动相应与凝胶非常相似，以便浸润凝胶并防止其吸附作用的发生。对于扩散系数相当低的大分子，流动相溶剂自身的黏度也会影响分辨率。一般来讲，分离高分子有机化合物时，主要采用四氢呋喃、甲苯、间甲苯酚、N，N-二甲基甲酰胺等作流动相；分离生物样品时，主要采用水、盐缓冲溶液、乙醇以及丙酮等作流动相。