如何正确使用吸光度法测定物质浓度？

1.吸光度与透光度

当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一部分光被吸收，另有一部分光透过溶液（见图5-1-1）。设入射光强度为I₀，透射光强度为I_t，则I_t和I₀之比称为透光度（T）。T×100为T%，称为百分透光度。

图5-1-1 光通过溶液示意图

透光度的负对数称为吸光度，即

A值越大，表示物质对光的吸收程度越大。分光光度法既可以测定液体样品，也可以测定固体样品和气体样品，但一般都将样品制成溶液进行测量。

2.Lambert-Beer定律

Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度与溶液浓度和液层厚度之间关系的基本定律，是吸光光度分析的理论基础。其表达式为

A=Kbc

式中 A——吸光度；

K——比例常数，称为吸光系数；(www.xing528.com)

b——液层厚度，称为光径；

c——溶液浓度。

Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。根据Lambert-Beer定律，当液层厚度单位为cm，浓度单位为mol/L时，吸光系数K称为摩尔吸光系数（ε），单位为L/（mol·cm）。ε的意义是：当液层厚度为1cm，浓度为1mol/L时，在特定波长下的吸光度。ε反映吸光物质对光的吸收能力，也反映可用吸光光度法测定该吸光物质的灵敏度。在一定条件下，某吸光物质的ε值为一常数。同一物质与不同显色剂反应生成不同有色化合物时，具有不同的ε值。因此，ε值是选择显色反应的重要依据。

3.偏离Lambert-Beer定律的因素

根据Lambert-Beer定律，A与c的关系应是一条通过原点的直线，称为标准曲线，但事实上往往容易发生偏离直线的现象而引起误差（见图5-1-2），尤其在高浓度时。此种偏离主要来源于Lambert-Beer定律本身的局限性、化学因素和光学因素等。

（1）Lambert-Beer定律本身的局限性 Lambert-Beer定律适用于浓度小于0.01mol/L的稀溶液。吸光系数与浓度无关，但与折射率有关。在高浓度时，由于折射率随着浓度的增加而增加，因此，引起偏离Lambert-Beer定律。

图5-1-2 标准曲线及对Lambert-Beer定律的偏离

入射光通过具有不同折射率的两种介质的界面时，会发生反射作用。若被测溶液的折射率和空白溶液的折射率基本相同，则发射作用的影响互相抵消。当被测溶液的浓度增加时，两者的差异增大，校正曲线不通过零点。为了校正或消除这种差异，测定时可用空白溶液做相对校正。空白溶液应与被测溶液的组成相近，且两者应装入大小、形状和材料相同的吸收池中。

（2）化学因素 溶液对光的吸收程度取决于吸光物质的性质和数目。若溶液中发生了电离、酸碱反应、配位反应等，则会改变吸光物质的浓度，导致偏离Lambert-Beer定律。若化学反应使吸光物质浓度降低，而产物在测量波长处不吸收，则会引起负偏离；若产物比原吸光物质在测量波长处的吸收更强，则会引起正偏离。

（3）光学因素 Lambert-Beer定律要求入射光是单色光。但在目前的分光条件下，能分出的单色光并不是严格的单色光，而是包括一定波长范围的光谱带（此波长范围即谱带宽度）。其他波长的杂色光是引起误差的主要原因。入射光的谱带越宽，其误差越大。