阳离子交换型蛋白吸附分离膜的优化

9.3.1.1　改性再生纤维素纳米纤维蛋白吸附分离膜

纤维素表面羟基含量丰富，易于接枝功能化改性，已经被广泛应用于高精度蛋白质的分离纯化领域［56］。将醋酸纤维素（CA）纳米纤维膜水解后通过浸渍接枝改性将马来酸酐（MA）接枝在其表面，得到羧基化改性纤维素纳米纤维膜（CMA）［57］。图9-15（a）为CA纳米纤维膜的FE-SEM图，从图中可以看出，纤维膜表面光滑，其水接触角约为60°，纤维直径约为248nm。从图9-15（b）可以看出，醋酸纤维素水解脱去乙酰基后得到纤维素纳米纤维膜，其纤维间存在黏结点，且纤维膜变为超亲水材料，这是由于纤维素分子链上的羟基数量增加。从图9-15（c）可以看出，经MA羧基化改性后的纤维素纳米纤维间的交联作用更加显著，单根纤维屈曲程度更加明显，同时纤维直径略有增加至272nm。图9-15（d）为相关纤维膜的FT-IR图谱，3409cm-1、1731cm-1、1340cm-1分别是羟基、羰基和醚键的特征峰，纤维素纳米纤维膜的羟基峰强明显高于醋酸纤维素，而CMA纤维膜的羟基峰减弱，羰基和醚键峰增强，这主要是因为纤维素表面的羟基与MA上的羧酸基团发生酯化反应，使羰基和醚键的数量增加，羟基的数量减少。

图9-15　（a）醋酸纤维素（b）纤维素及（c）CMA纳米纤维膜的FE-SEM图，插图为其水接触角照片；（d）相关纳米纤维膜的FT-IR图谱

图9-16（a）为不同MA浓度改性的纤维膜对正电性溶菌酶（LSZ）的吸附曲线，随着改性液中MA浓度的增加，纤维膜对蛋白的饱和吸附量也不断增加，当MA的质量分数为3wt%时，CMA纳米纤维膜达到最大饱和吸附量160mg/g。蛋白质与离子交换材料之间的作用力为静电力，而溶液的pH影响蛋白质上所带的电荷，进一步影响其饱和吸附量，因此，蛋白质溶液的pH是影响CMA的饱和吸附量的重要因素。图9-16（b）为蛋白质溶液的pH对LSZ吸附量影响的曲线，当pH小于6时，CMA的饱和吸附量稳定在157～171mg/g区，随着LSZ溶液的pH继续增加，纤维膜的饱和吸附量明显下降，在pH=8时，纤维膜几乎无法吸附蛋白。这是由于LSZ的等电点（PI）为10.8，当溶液的pH逐渐增加至10.8时，LSZ的正电性减弱使其与CMA间的静电力减小，从而导致蛋白质的饱和吸附量下降。图9-16（c）为LSZ的初始浓度对纤维膜吸附性能的影响曲线，随着LSZ初始浓度的增加，CMA的静态饱和吸附量逐渐增加，当LSZ的初始浓度为1mg/mL时，纤维膜的吸附量达到最大。图9-16（d）为CMA对LSZ的动力学吸附性能，随着吸附时间的增加，纤维膜的蛋白吸附量迅速增加，到12h后达到吸附平衡状态。

图9-16　（a）不同MA含量改性的纤维膜对溶菌酶的饱和吸附曲线；（b）溶液的pH对溶菌酶饱和吸附量的影响；（c）纤维膜在不同初始浓度条件下的吸附曲线；（d）不同时间条件下溶菌酶吸附动力曲线

图9-17　CMA纳米纤维膜（a）对溶菌酶的穿透吸附曲线与（b）循环使用性能

蛋白质的吸附分离是指其在流动过程中与纤维膜固定相发生离子交换，在重力驱动下（750Pa），CMA的动态吸附效率及吸附平衡量如图9-17（a）所示。CMA纤维膜对前2mL LSZ的吸附分离效率几乎为100%，随后吸附量降低，当LSZ溶液透过量为12mL时动态吸附量达到饱和（118mg/g）。对饱和吸附的纤维膜进行脱附，得到可再次使用的纤维膜并对其循环使用性能进行了测试。如图9-17（b）所示，在第10个吸附—脱附循环时纤维膜的饱和吸附量仍稳定在160mg/g左右，且纤维膜的形貌结构未发生明显变化，这是由于CMA纤维间具有稳定的黏结结构，因而在循环使用过程中其多级孔结构没有发生改变。与目前商业用纯化蛋白质的再生纤维素纤维膜相比，CMA纳米纤维膜具有动态吸附量大、压降低及节能可再生的优点，具有非常广阔的应用前景。

9.3.1.2　改性PVA纳米纤维蛋白吸附分离膜

PVA具有亲水性好、易于功能化改性、生物相容性优良且毒性小等优点，通过静电纺丝技术制备了PVA/MA复合纳米纤维膜，纤维平均直径为300nm。将所得的纤维膜在100℃下加热1h，PVA分子链上的羟基与MA分子链上的羧酸基团在多聚磷酸的催化作用下发生酯化反应，交联后纤维间形成了均匀分布的稳定黏结点，大幅提升了材料的结构稳定性，具体制备过程如图9-18所示［58］。

图9-18　PVA/MA纳米纤维膜的原位交联和羧酸化示意图

图9-19　PVA/MA纳米纤维膜的（a）选择吸附性能；（b）循环使用性能

羧酸化后的PVA纳米纤维膜比表面积大、孔道连通性好，为蛋白吸附提供了丰富的活性位点。当PVA与MA的摩尔比为7/3时，PVA/MA纤维膜对LSZ的吸附量达到最大为177mg/g，饱和吸附平衡时间仅需4h，且在重力驱动下（阻力压降为750Pa）动态饱和吸附量可达159mg/g。图9-19（a）为纤维膜对不同蛋白的选择吸附性能，其中正电性蛋白包括LSZ（PI为10.8）、菠萝蛋白酶（PI为9.5）、木瓜蛋白酶（PI为8.75），负电性蛋白包括牛血清蛋白（PI为4.8）、卵清蛋白（PI为4.7）、胃蛋白酶（PI为1）。PVA/MA纤维膜为阳离子交换材料，其在水溶液中电离形成羧基（带负电），可与溶液中带正电的蛋白产生静电吸引力，从而使蛋白吸附于纤维膜表面；而不同的带正电荷蛋白由于分子尺寸和等电点不同导致其与纤维膜间的静电作用力存在强弱差异，因而，纤维膜对不同的正电性蛋白的吸附性能不同。结果表明PVA/MA仅能吸附带正电的LSZ、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶，吸附量分别为177mg/g、34mg/g和85mg/g。此外，图9-19（b）显示10次循环吸附—脱附后纤维膜的饱和吸附量几乎保持稳定不变，表明PVA/MA纤维膜具有良好的循环使用性能。(www.xing528.com)

9.3.1.3　改性EVOH纳米纤维蛋白吸附分离膜

EVOH具有良好的化学稳定性，其亲水但不溶于水的特性有利于减少蛋白的非特异性吸附，同时EVOH表面具有丰富的羟基官能团可用于后续的接枝改性。柠檬酸（CCA）分子链上含有三个羧基官能团，其相对较长的碳链减少了吸附官能团与蛋白质之间的位阻，提升了活性吸附位点的有效性。将静电纺EVOH纳米纤维膜浸渍到CCA和多聚磷酸（PPA）的溶液中进行表面接枝改性，构筑了具有高效蛋白吸附性能的CCA接枝改性EVOH纳米纤维膜（EVOH—CCA NFM）［59］，具体制备过程如图9-20所示。

图9-20　EVOH-CCA纳米纤维膜的制备及其蛋白吸附分离应用过程示意图

通过比较EVOH—CCA纳米纤维膜、EVOH—CCA平滑膜与EVOH/CCA混纺纳米纤维膜对蛋白的吸附量，分析了吸附材料的结构对蛋白质吸附性能的影响，如图9-21所示。其中接枝改性的EVOH—CCA纳米纤维膜对LSZ的蛋白吸附量最大，为284mg/g，这是由于纳米纤维的比表面积大、孔隙率高，且接枝改性的纳米纤维直径小于混纺后纤维的直径，使得纤维表面活性吸附位点多，可以吸附溶液中更多的蛋白质。另外，EVOH—CCA纳米纤维膜浸渍接枝改性的方法简单、易于操作，结合多喷头静电纺丝装置，可以获得大尺寸（65cm×60cm）的EVOH—CCA纳米纤维膜（图9-21的插图），有望实现工业化的大规模生产。

图9-21　不同种类纤维膜的蛋白吸附性能比较，插图为65cm×60cm的EVOH—CCA纳米纤维膜