酶联免疫吸附和PCR检测技术应用解析

酶联免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高效催化作用有机结合的一种方法。它以与抗体或抗原连接的酶作为标记物，通过底物的颜色反应做抗原或抗体的定性和定量检测。目前应用最多的酶联免疫技术是酶联免疫吸附法（ELISA）。

（一）ELISA法的基本原理

先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗原或抗体发生反应，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分，然后根据底物颜色的有无及颜色的深浅判断阴性或阳性反应及反应强度，因此可以用于定性或定量分析。

（二）目前常用的ELISA方法

1. 间接ELISA法

将已知抗原吸附在聚苯乙烯微量反应板的凹孔内，加入待测抗体，保温后形成抗原抗体复合物，洗去未结合的杂蛋白。加入酶标第二抗体，保温后洗去未结合的酶标第二抗体，加入底物后生成有色产物，终止酶促反应，比色法测定吸光度值。

2. 双抗体夹心ELISA法

双抗体夹心法是检测抗原最常用的ELISA法，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原。其基本工作原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的，因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量（吸光度值），即可确定待测抗原含量。

3. 竞争ELISA法

将含有特异抗体的免疫球蛋白吸附在两份相同的载体A和B上，然后在A中加入酶标抗原和待测抗原，B中只加入酶标抗原，其浓度与A中加入的酶标抗原的浓度相同。保温洗涤后加入底物呈色。待测液中未知抗原量愈多，则酶标抗原被结合的量就愈少，有色产物就愈少，以此便可以测出未知抗原的量。

（三）ELISA法的特点

（1）抗原与抗体的免疫反应是专一反应，而ELISA以免疫反应为基础，所检测的对象是抗原（或抗体），因此具有高度特异性。

（2）酶联免疫吸附法是利用抗原抗体的免疫学反应和酶的高效催化底物反应的特点，具有生物放大作用，所以反应灵敏，可检出浓度在纳克级水平。

（3）所使用的试剂都比较稳定，按照一定的试验程序进行测定，试验结果重复性好，有较高的准确性，而且操作简便，可同时快速测定多个样品。

（四）ELISA法在食品检测中的应用

1. 检测食品微生物及毒素

沙门菌是一种典型的病原微生物。应用一种全自动ELISA沙门菌检测系统，将抗体包被到凹形金属片的内面，吸附被检样品中的沙门氏菌，只要把样品加到测定试剂孔，其余全部为自动分析，与传统分析法相比效率大大提高。此外，也可应用ELISA法检测金黄色葡萄球菌肠毒素等。

2. 检测食品中残留的农药

传统的农药残留检测方法如气相色谱法和高效液相色谱法能精确地检测残留的农药量，但需要昂贵的仪器设备、复杂的前处理、专业技术人员及较长的分析周期。近年来，农药的免疫检测技术作为快速筛选检测方法得到了快速发展。目前几乎所有农药类别都建立了酶联免疫分析方法，检测样本以农产品、食品、饲料和环境为主。欧洲、美国、日本、巴西等多个国家应用该技术对农产品中有毒物质残留进行生物技术监测研究。最近研制的通用型有机磷杀虫剂免疫检测试剂盒可以同时检测8种以上的有机磷农药。

3. 检测重金属污染

生物细胞在环境受重金属污染（Cu、Hg、Cd、Pb等金属离子）的情况下，可被诱导合成出大量的金属硫蛋白，是一项对金属污染具有特异性的指标。金属硫蛋白是一类对重金属离子有很强亲和力、含丰富的半胱氨酸、不含芳香族氨基酸和组氨酸的低分子质量蛋白质。金属硫蛋白含有大量的巯基（—SH），能与重金属离子结合，对细胞内的金属离子有重要的解毒作用。用纯化的金属硫蛋白对兔进行免疫，获得的兔血清经纯化后标记辣根过氧化酶，应用酶联免疫吸附法可实现对食品中重金属污染的超微量检测。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）体外扩增DNA已成为应用最广泛的一种生物技术。1985年K. Mullis在研究DNA聚合酶反应时发明了这项技术。最初采用Klenow酶来扩增DNA，但每次加热变性DNA时都会使酶失活，需要重新添加DNA聚合酶，因此使用不方便。1988年Saiki等用耐热的TaqDNA聚合酶取代Klenow酶之后，才使这项技术成熟，从而被各方面应用。

（一）PCR技术基本原理

一个典型的PCR反应过程包括多个“变性（Denaturation）、退火（Annealing）、延伸（E-longation）”循环。其一般反应过程如下。

（1）变性将体系加热至95℃左右并维持一定时间，使模板DNA互补双链解离成单链DNA，以便它与引物结合，为下轮反应做准备。

（2）退火将体系温度降低至50～60℃（一般以55℃作为初选），让寡核苷酸引物与模板DNA单链上的互补序列杂交。同时，体系中的DNA聚合酶在此温度下也被部分激活，一旦引物与模板杂交，DNA聚合酶就结合到杂交序列上使引物开始沿着模板DNA延伸。

（3）延伸将反应体系升温至DNA聚合酶的最佳扩增温度（大多数酶为72℃），使引物延伸以最快速度完成。与模板DNA结合的引物在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的DNA链。

（4）重复以上3步，根据所需产量，循环25～40次。(www.xing528.com)

（5）将体系温度保持在DNA聚合酶的最佳扩增温度数分钟，使体系中未完成延伸的DNA链得以继续完成。

（6）将体系温度降低至4℃，结束PCR过程。

（二）PCR技术的特点

PCR技术得以广泛应用，主要因其具有以下特点。

（1）高特异性 PCR的特异性主要指扩增产物的专一性。扩增产物的专一性由引物与DNA模板中靶序列互补的专一性决定，即取决于引物与模板DNA互补的特异性。因此，PCR引物的设计直接关系着PCR反应的成败，要尽可能地避开重复序列，尽可能选择模板DNA中的单拷贝区。

（2）高敏感性 PCR技术具有高度的敏感性，然而，高度的敏感性也使PCR反应极易产生交叉污染，因为如果反应条件特异性不高，极微量的污染物就能够产生大量的非特异性片段。

（3）高产率 PCR技术能在2～3h内将靶DNA序列扩增到上百万倍的水平。

（三）常用的PCR技术

1. 普通PCR

这是目前应用最为广泛的技术，是其它PCR技术的基础。通过对要扩增的目标DNA序列设计特异引物（或简并引物），优化反应条件，达到对目标序列扩增的目的。普通PCR技术广泛应用于分子生物学研究的各个领域，如病原菌的检测、转基因生物的检测、疾病的检测、基因的克隆、基因工程载体的构建等。

2. 巢式PCR

巢式PCR技术是一种消除假阴性、假阳性，提高灵敏度的方法。巢式PCR技术设计两对引物，其中一对引物结合的位点在另一对引物扩增的产物之中。首先扩增大片段，然后以第一次扩增的产物作为模板，进行第二次扩增，这样通过产物的琼脂糖凝胶电泳比较就可以知道检测结果。如果第一次扩增是非特异的，而且扩增的片段大小与设计的相似，在电泳中无法区别，这时通过第二次扩增，由于第二对引物与扩增产物中没有配对的序列，因此不能扩增出产物。这样就消除了假阳性的干扰。同时，由于第一次扩增起到模板数量放大的作用，可使检测的灵敏度增加3～6个数量级。

3. 多重PCR

多重PCR技术是在同一PCR反应体系里加入两对或两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。在许多领域，包括基因缺失分析、突变和多态性分析、定量分析等，多重PCR技术已经凸显它的价值，成为识别病毒、细菌、真菌和寄生虫的有效方法。

4. 降落PCR

降落PCR（TD PCR）主要用于优化PCR的反应条件。为了寻找最佳退火温度，设计多循环反应的程序以使相连循环的退火温度越来越低，由于开始的退火温度选在高于估计的T_m值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到了T_m值。并最终低于这个水平。这个策略有利于确保第一个引物—模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，不会产生非特异的PCR产物。最后虽然退火温度降到PCR特异的杂交T_m值，但此时目的产物已经开始扩增，在剩下的循环中处于超过任何滞后（非特异）PCR产物的地位，这样非特异产物不会占据主导地位。

5. 反转录PCR

反转录PCR（RT-PCR）是在反转录酶的作用下，将mRNA反转录成cDNA，然后再采用PCR对cDNA进行扩增和分析，从而实现对mRNA分析的方法。该方法将反转录和PCR结合在一起，是一种快速、简便、灵敏地测定mRNA的方法，运用这种方法可以检测出单个细胞中少于10个拷贝的mRNA。在RT-PCR中，以RNA为模板，结合反转录反应与PCR，为RNA病毒检测提供了方便，也为获得与特定RNA互补的cDNA提供了一条极为有利和有效的途径。

6. 原位PCR

原位PCR（In Situ PCR）就是在组织细胞里进行的PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，既能分辨、鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列的位置，对在分子和细胞水平上研究疾病的发病机理等有重要的实用价值。原位PCR的基本操作步骤是：①将组织切片或细胞固定在玻片上；②蛋白酶K消化处理组织切片或细胞；③加适量的PCR反应液于处理后的材料处，盖上盖玻片，并以液体石蜡密封，然后直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩增；④PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交；⑤显微镜观察结果。原位PCR是在载玻片上进行PCR，所以有时也称为玻片PCR。

7. 竞争性PCR

竞争性PCR（Competitive PCR）是在PCR扩增时同时加入靶核酸模板和竞争核酸模板，它们在反应体系中竞争反应底物，当靶RNA模板的浓度高时，其扩增产物多，相应地竞争RNA模板的扩增产物就少，反之，靶RNA模板的产物少，竞争RNA模板的产物多。将不同浓度的竞争模板和特定量靶模板混合后，分别进行扩增，分析两种扩增产物的比值，以竞争RNA模板浓度为横坐标，两种扩增产物的比值为纵坐标作图，得到竞争曲线。当两种产物的比值等于1时，靶模板和竞争模板的量相等。因此，从曲线上可以得到靶模板的含量，从而实现靶模板的定量检测。

8. 实时定量PCR

实时定量PCR（Real-Time PCR）是近年来发展起来的新技术，这种方法既保持了PCR技术灵敏、快速的特点，又克服了以往PCR技术中存在的假阳性污染和不能进行准确定量的缺点。实时定量PCR技术是从传统PCR技术发展而来，其基本原理相同，但定量技术原理不同。实时定量技术应用了荧光染料和探针来保证扩增的特异性，并且通过荧光信号的强弱而准确定量。该技术在基因突变的检测、基因表达的研究、微生物的检测、转基因食品的检测等领域均有重要的应用价值。

（四）PCR技术在食品检测中的应用

食品中污染微生物的种类很多，即使同一种食品中的微生物种类也很多，因此很难用传统的检测方法分离出食品中的所有微生物，尤其是弱势菌。而应用PCR技术检测这些微生物可以避免这些问题。PCR技术已成为调查食源性疾病暴发及鉴定相应病原菌的有力工具，可以提高检测灵敏度、缩短操作时间、提高检出率、有效检测食品中的致病微生物。随着人们对食品安全性要求的不断提高，PCR技术将以其特异性强、灵敏度高和快速准确等优点在食品检测领域得到广泛的应用。