生物芯片和传感器的检测技术

生物芯片（Biochip）是20世纪90年代初发展起来的一种微量分析技术。该技术采用光导原位合成或微量点样等方法，将核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品按一定的顺序固化于支持物（如玻片、硅片等载体）的表面，组成密集二维排列，然后与已标记的待测生物样品中的靶分子杂交，通过特定的仪器（如激光共聚焦扫描仪等）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效的检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。由于常用玻片或硅片作为固相支持物，且在制备过程中模拟计算机芯片的制备技术，所以将其称之为生物芯片技术。它综合了分子生物学、免疫学、微电子学、微机械学、化学、物理学、计算机技术等多项技术，具有高通量、微型化、自动化和信息化的特点，在食品检测中有着广阔的发展前景。

（一）生物芯片的分类

生物芯片种类较多，根据芯片上固定探针的不同，生物芯片分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片等；以其片基的不同分为无机片基芯片和有机合成物片基芯片；按其应用的不同可以分为表达谱芯片、诊断芯片、检测芯片。其中应用最多、应用范围最广的生物芯片是基因芯片。

1. 基因芯片

基因芯片（Gene Chip）通常指DNA芯片，利用核酸杂交原理来检测未知分子。首先将大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱来判断样品中靶分子的数量。基因芯片技术问世以来，由于其具有微型化、集约化和标准化的特点，在分子生物学研究、食品检测、医学临床检验、生物制药和环境学等领域显示出了强大的生命力。

基因芯片的技术流程包括芯片的制作、样品的制备、芯片的杂交及杂交后信号的检测和分析。基因芯片制备方法主要包括两种。①点样法。将不同的核酸溶液逐点分配在固相支持物的不同部位，然后通过物理和化学的方法使之固定。②原位合成法。在玻璃等硬质表面直接合成寡核苷酸探针阵列，目前应用的方法主要有光去保护并行合成法、压电打印合成法等。样品的制备和处理是基因芯片技术的第二个重要环节。生物样品往往是非常复杂的生物分子混合物，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应。可将样品进行生物处理，提取其中的核酸并加以标记，以提高检测的灵敏度。基因芯片与靶基因的杂交过程和一般的分子杂交过程基本相同，杂交反应的条件需根据探针长度、GC碱基含量及芯片的类型来优化。用同位素标记靶基因，其后的信号检测即是放射自显影；也可以用荧光标记，应用荧光扫描及分析系统对相应探针阵列上的荧光强度进行比较，得到待测样品的相应信息，再进行结果分析。

2. 蛋白质芯片

蛋白质芯片（Protein Chip）是在基因芯片的基础上发展起来的，是大量的蛋白质分子（如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等）或肽链有序固定在载体上形成的。蛋白质与载体表面结合，同时仍保留蛋白质的物理和化学性质，利用蛋白质或肽链特异性地与配体分子（如抗体或抗原）结合的原理进行检测。

由于蛋白质不能靠扩增的方法达到要求的灵敏度，蛋白质之间的特异作用是利用抗原与抗体反应，所以检测蛋白质沿用基因芯片的模式有一定的局限性。此外，蛋白质很难在固相载体表面合成，并且固体表面的蛋白质易于改变空间构型，失去生物活性，所以蛋白质芯片的制作比基因芯片复杂。构建蛋白质阵列需解决三个问题：①保证蛋白质正确定位；②保持蛋白的活性；③与现存的基因芯片研究工具相兼容。

3. 芯片缩微实验室

芯片缩微实验室（Microlab on a Chip）是将各种功能的芯片集约在同一载体（通常为硅片）上形成的多功能芯片。在芯片缩微实验室中，各芯片之间是在计算机的控制下通过微流路、微泵和微阀等实现有序联系的。它集样品制备、基因扩增、核酸标记及检测为一体，实现了生化分析全过程，是生物芯片发展的最高阶段。芯片缩微实验室能实现分析过程的微量化和集约化，从而节约时间、经费和人力，使工作效率大大提高。由于芯片缩微实验室利用微加工技术，浓缩了整个实验室所需的设备，因此，化验、检测以及显示等都会在一块芯片上完成，所需样品微量，成本相对低廉，而且使用非常方便。这类仪器的出现将给生命科学研究、疾病诊断和治疗、新药开发、司法鉴定、食品卫生监督等领域带来一场革命。

（二）生物芯片在食品检测中的应用

1. 在食品微生物检测中的应用

食品卫生检测中一个重要的方面是及时准确地检测出食品中的病原微生物，这些病原微生物的存在会严重危害人类的健康，而食品在生产、加工、运输、销售、消费的各个环节都极易被各种病菌污染。采用基因芯片技术可以实现致病菌的快速检测。

首先利用在细菌学分类上具有重要意义的16SrRNA基因作为检测的靶分子，并在其间设计检测探针，建立一套致病菌的基因芯片快速检测技术。不同细菌的16SrRNA基因具有序列一致的恒定区和序列互不相同的可变区，恒定区和可变区交错排列。这样，在恒定区设计PCR引物，在可变区设计检测探针，用一对PCR引物就可以将所有细菌的相应基因片段全部扩增出来。然后用每种细菌的特异性探针阵列与标记的靶片段进行杂交反应，杂交后用专用设备分析荧光信号，可以定性和半定量地检测出致病菌。用这种芯片可以检出副溶血弧菌、李斯特氏菌、耶尔森菌、变形杆菌及铜绿假单胞菌等，但是由于肠道致病菌（沙门氏菌、志贺氏菌和大肠杆菌等）探针所在的16SrRNA序列基本相同，所以只能作为一类细菌被检出。也可分别采用invA基因、virA基因及23SrRNA基因等为模板，设计引物和探针，进行肠道致病菌的区分检测，将沙门氏菌、志贺氏菌和大肠杆菌等准确检出。

2. 在食品毒理学研究中的应用

传统的食品毒理学研究必须通过动物试验来进行模糊评判，它们在研究毒物的整体毒性效应和毒物代谢方面具有不可替代的作用。但是，由于需要消耗大量的动物，费时费力，而且所用的动物模型由于种属差异，得出的结果往往并不适宜外推至人。另外，动物试验中所给予的毒物剂量远远大于人的暴露水平，因此不能反映真实的暴露情况。生物芯片技术的应用将给毒理学领域带来一场革命。生物芯片可以同时对几千个基因的表达进行分析，为新型食品资源对人体影响的机理研究提供完整的技术资料，并通过对单个或多个混合有害成分进行分析，确定该化学物质在低剂量条件下的毒性，分析推断出该物质的最低限量。美国环境卫生科学研究所的科学家开发了一种毒理芯片（Toxchip），虽然它不能完全取代动物试验，但它可以提供有价值的信息而大大减少动物消耗、经费和时间。因基因表达对低剂量也很敏感，所以它用于生物学试验时，可在近似于人暴露的低剂量水平进行研究，这样就可以避免试验结果由动物外推至人时所产生的误差，更真实地反映暴露水平下人体对化学物的反应。另外，微阵列芯片可以在基因水平帮助探索急性和慢性中毒之间的联系，通过观察暴露时间和毒性所致的基因表达谱改变其之间的关系，可以由急性中毒监测慢性毒性效应，这意味着会缩短生物试验时间，并使试验剂量更接近于现实和节省相当可观的费用。

生物芯片技术已逐渐成为食品领域的研究热点，但该技术本身还有许多需要改进之处。首先，生物芯片的制作需要大量已测知的、准确的DNA、cDNA片段、抗原、抗体等信息。其次，目前生物芯片在技术上会呈现假阳性、假阴性。再次，样品制备和标记比较复杂，没有一个统一的质量控制标准。这些都在一定程度上限制了生物芯片技术在食品检测中的应用。生物芯片技术尽管存在一定的不足和局限，但该技术具有检测系统微型化、检测样品微量化的特点，同时兼具检测效率高的优点。随着研究的不断深入和技术的完善，生物芯片技术一定会在食品科学研究领域发挥越来越重要的作用。

（一）生物传感器的结构及特点

生物传感器是一种以生物活性单元（如酶、抗体、核酸、细胞等）作为敏感基元，对被分析物具有高度选择性的现代化分析仪器。它通过各种物理、化学换能器捕捉目标物与敏感基元之间的反应，然后将反应的程度用离散或连续的电信号表达出来，从而得出被分析物的浓度。信号的强弱在一定条件下与被测定的分子之间存在一定的比例关系，根据信号的强弱可以进行待测物质的分析、测定。

第一个生物传感器——葡萄糖传感器，是在1967年制造出来的。将葡萄糖氧化酶包含在聚丙烯酰胺胶体中加以固化，再将此胶体膜固定在隔膜氧电极的尖端上，便制成了葡萄糖传感器。改用其它的酶或微生物等固化膜，便可制得检测其对应物的其它传感器。(www.xing528.com)

生物传感器大致经历了三个发展阶段。第一代生物传感器是由固定了生物成分的非活性基质膜和电化学电极所组成；第二代生物传感器是将生物成分直接吸附或共价结合到转换器的表面，而无须非活性的基质膜，测定时不必向样品中加入其它试剂；第三代生物传感器是把生物成分直接固定在电器元件上，它们可以直接感知和放大界面物质的变化，从而把生物识别和信号的转换处理结合在一起。

生物传感器具有以下共同的结构：一种或数种相关生物活性材料及将其表达的信号转换为电信号的物理或化学换能器（传感器），二者组合在一起，用现代微电子和自动化仪表技术进行生物信号的再加工，构成各种可以使用的生物传感器分析装置、仪器和系统。

与传统方法相比，生物传感器具有如下优点。

（1）生物传感器是由选择性好的生物材料构成的分子识别元件，因此一般不需要样品的预处理，样品中的被测组分的分离和检测同时完成，且测定时一般不需加入其它试剂。

（2）可以实现连续在线监测。

（3）分析速度快，样品用量少，可以反复多次使用。

（4）传感器连同测定仪的成本远低于大型的分析仪器，便于推广普及。

（二）生物传感器在食品检测中的应用

1. 对食品微生物及毒素的检测

传统微生物检测方法一般都涉及对病原微生物的培养，形态及生理生化特性分析等程序，不仅成本高，且速度慢、效率低，故食品行业一直渴求快速、可靠、简便的检测系统，而生物传感器检测可满足这些要求。应用压电晶体传感器、光纤免疫传感器、酶标免疫传感器等可以测定食品中的病原微生物。此外，应用双通道的表面声波生物传感器可以同时检测两种不同的微生物。应用免疫传感器可以实现鼠伤寒沙门氏菌的快速检测。

食品中的毒素不仅种类很多，且毒性大，大多有致癌、致畸、致突变作用。因此，加强对食品中毒素的检测至关重要。应用表面等离子体共振免疫传感器和光纤免疫传感器检测玉米抽提物中天然污染的主要毒素组分伏马菌素B的浓度，检测下限分别达到50ng/mL和10ng/mL。葡萄球菌肠毒素是引起人类食物中毒的主要原因，通过光纤传感器来测定火腿抽提物中该种毒素，检测灵敏度为5ng/mL。同样，可用生物传感器检测的毒素还有蓖麻毒素、肉毒毒素等。

2. 对农药残留的检测

近年来，国内外学者就生物传感器在农药残留检测领域中的应用做了一些有益的探索。利用生物传感器的方法可以检测即食食品中杀虫剂残留物（如有机磷酸酯和氨基甲酸盐），与传统检测方法相对比，生物传感器测定法与传统方法的检测结果较吻合，且无须对检测样品进行提取或预浓缩等复杂的前处理，检测灵敏度高，操作简便快捷。此外，表面等离子共振检测技术也可应用于农药检测研究，表面等离子共振检测技术生物传感器体积小、成本低，响应快、灵敏度高、实时在线检测和抗干扰能力强，因而非常适合用于现场的农药残留检测。

采用电导型生物传感器对食品农药如甲基马拉松、乙基马拉松、敌百虫等进行了测定，检出下限分别为5 × 10^-7mol/L、1 × 10^-8mol/L、5 × 10^-7mol/L。采用免疫传感器测定牛乳中磺胺二甲嘧啶，检出限低于1×10^-9mol/L，传感器表面经处理后可重复使用。此外，分别用乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BChE）为敏感元件，利用农药对靶标酶的活性抑制作用研制的传感器，可用于蔬菜等样品中有机磷农药的测定。

但是，目前在实际应用中由于检测限、灵敏度、重复性等问题，生物传感器在农药残留检测的实际应用上还有许多局限，大都只作为一种对大量样品进行快速筛选的方法和手段。因此，生物传感器在这一领域应用的潜力还有待于进一步发掘。

3. 对食品添加剂的检测

亚硫酸盐通常用作食品工业的漂白剂和防腐剂。采用亚硫酸盐氧化酶为敏感材料，制成电流型二氧化硫酶电极，可用于果干、酒、醋、果汁等食品中亚硫酸盐的测定。苯甲酸盐是食品工业中常用的另一种防腐剂，可用于软饮料、酱油和醋等食品中，通常采用气相色谱法测定，因此需要专有设备。应用NADPH作为电子传递体，根据苯甲酸盐氧化过程中氧的消失而导致的电流信号变化，可以制成苯甲酸盐酶电极，测定结果与气相色谱法分析结果一致。在乳酸含量的测定中，应用乳酸氧化酶电流式生物传感器分析发酵液或酒中的乳酸含量，可用于葡萄酒发酵过程的控制和优化，以及葡萄酒品质控制。

4. 对食品中重金属的检测

由于铅、汞等重金属离子可以在生物体内不断的沉积和富集，它们的污染对食品的品质和人类的健康都造成了极大的威胁。检测重金属离子的生物传感器主要基于重金属离子可以造成氧化酶和脱氢酶失活的原理，选择合适的酶并将其固定于亲和性膜上，结合Clark氧电极，通过计算氧的消耗速率就可以推知重金属的污染程度。目前，已有研究者以谷胱甘肽作为水溶液中检测重金属离子的生物传感器的生物识别元件。生物识别元件被固定在合适的信号转换器表面，由于连接金属离子的影响而在固定化肽层中产生的变化（氢离子释放、质量及光学特征变化）可被转换器转换成电信号。因此，谷胱甘肽适合作为重金属生物传感器的生物识别元件。

生物传感器作为一门实用性很强的高新技术，在各个现代科学和技术领域里具有潜在的应用前景，因此备受人们的青睐。但迄今为止，除少数的生物传感器应用于实际测定外，大多还存在着急需解决的问题，如一些生物识别元件的长期稳定性、可靠性、一致性等方面有待提高。人们已经着力于新材料的开发和多功能集成型、智能型及仿生传感器的研究了。随着科技的发展，生物传感器在各个方面将会占据主导地位。