紫外可见分光光度计介绍

1.仪器主要组成

紫外―可见分光光度计的基本结构都是由五部分组成，即光源、单色器、吸收池（样品室）、检测器和信号读出装置，如图5―19所示。

图5―19　单波长单光束分光光度计基本结构示意图

（1）光源。光源的作用是提供分析所需的复合光。一般采用钨灯（350～800nm，适用于可见光区）和氘灯（190～400nm，适用于紫外光区），根据不同波长的要求选择使用。光源要有一定的强度且稳定。

（2）单色器。单色器的作用是将光源发出的复合光分解为按波长顺序排列的单色光。它的性能直接影响入射光的单色性，从而影响测定的灵敏度、选择性和校正曲线的线性关系等。单色器由入射狭缝、反射镜、色散元件、聚焦元件和出射狭缝等几部分组成，其关键部分是色散元件，起分光作用。色散元件有两种基本形式：棱镜和光栅。

①棱镜。由玻璃或石英制成。玻璃棱镜用于350～3200nm波长范围。它吸收紫外光而不能用于紫外分光光度分析。石英棱镜用于185～400nm波长范围，它可用于紫外―可见分光光度计中作分光元件。复合光通过棱镜时，由于棱镜材料的折射率不同而产生折射，折射率与入射光的波长有关。当复合光通过棱镜的两个界面发生两次折射后，根据折射定律，波长小的偏向角大，波长大的偏向角小（见图5―20），就能将复合光色散成不同波长的单色光。

图5―20　棱镜的色散作用

②光栅。光栅有多种，光谱仪中多采用平面闪耀光栅，即在高度刨光的表面（如铝）上刻画许多根平行线槽而成。一般为600条·mm―1，1200条·mm―1，有的可达2400条·mm―1，甚至更多。当复合光照射到光栅上时，光栅的每条刻线都产生衍射作用，而每条刻线所衍射的光又会互相干涉而产生干涉条纹。光波正是利用不同波长的入射光产生干涉条纹的衍射角不同，波长长的衍射角大，波长短的衍射角小，从而使复合光色散成按波长顺序排列的单色光。图5―21是光栅衍射原理示意图。

图5―21　闪耀光栅衍射的原理示意图

（3）吸收池。吸收池，也称样品室、比色皿等，用于盛放试液，由玻璃或石英制成。玻璃吸收池只能用于可见光区，而石英池既可用于可见光区，亦可用于紫外光区。一般分光光度计都配有不同厚度的吸收池，有0.5cm、1.0cm、2.0cm、3.0cm、5.0cm等规格供选择使用。

（4）检测器。检测器是一种光电转换元件，其作用是将透过吸收池的光信号强度转变成可测量的电信号强度，便于进行测量。在过去的光电比色计和低档的分光光度计中常用硒光电池。目前，紫外—可见分光光度计中多用光电管和光电倍增管。

①光电管。光电管是一个真空或充有少量惰性气体的二极管。阳极为一金属丝，阴极为半圆形的金属片，内表面涂有光敏物质。根据光敏材料的不同，光电管分为紫敏和红敏两种。前者是镍阴极涂有锑和铯，适用波长范围为200～625nm；后者阴极表面涂银和氧化铯，适用波长范围为625～1000nm。与光电池比较，它具有灵敏度高、光敏范围广、不易疲劳等优点。

②光电倍增管。光电倍增管是利用二次电子发射放大光电流的一种真空光敏器件。它由一个光电发射阴极、一个阳极以及若干级倍增极所组成。

当阴极K受到光撞击时，发出光电子，K释放的一次光电子再撞击倍增极，就可产生增加了若干倍的二次光电子，这些电子再与下一级倍增极撞击，电子数依次倍增，经过9～16极倍增，最后一次倍增极上产生的光电子可以比最初阴极放出的光电子多约106倍，最高可达109倍。最后倍增了的光电子射向阳极A形成电流。阳极电流与入射光强度及光电倍增管的增加成正比，改变光电倍增管的工作电压，可改变其增益。光电流通过光电倍增管的负载电阻R，即可变成电压信号，送入放大器进一步放大。

（5）信号读出装置。早期的分光光度计多采用检流计、微安表作为显示装置，直接读出吸光度或透射比。近代的分光光度计则多采用数字电压表等显示，或者用X―Y记录仪直接绘出吸收（或透射）曲线，并配有计算机数据处理平台。

2.紫外―可见分光光度计的类型

紫外―可见分光光度计分为单波长和双波长分光光度计两类。单波长分光光度计又分为单光束和双光束分光光度计。

（1）单波长单光束分光光度计。单波长单光束分光光度计的基本结构如图5―19所示。光源发出的混合光经单色器分光，其获得的单色光通过参比（或空白）吸收池后，照射在检测器上转换为电信号，并调节由读出装置显示的吸光度为零或透射比为100%，然后将装有被测试液的吸收池置于光路中，最后由读出装置显示试液的吸光度值。这种分光光度计结构简单，价格低廉，操作方便，维修容易，适用于在给定波长处测量吸光度或透射比，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。国产722型、751型、724型，英国SP500型以及BackmanDU―8型等均属于此类光度计。

（2）单波长双光束分光光度计。其工作原理见图5―22。经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光，一束通过参比池，另一束通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。双光束分光光度计一般都能自动记录吸收光谱曲线，进行快速全波段扫描。

图5―22　双光束分光光度计原理图

（3）双波长分光光度计。其基本光路如图5―23所示。由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单色器，得到两束不同波长（λ1和λ2）的单色光，利用切光器使两束光以一定的频率交替照射同一吸收池，然后经过光电倍增管和电子控制系统，最后由显示器显示出两个波长的吸光度差值ΔA（ΔA=Aλ1―Aλ2）。设波长为λ1和λ2的两束单色光的强度相等，则有

Aλ1=ελ1bc；Aλ2=ελ2bc

所以

图5―23　双波长分光光度计原理图

可见，ΔA与吸光物质的浓度成正比。这是用双波长分光光度法进行定量分析的理论依据。由于只用一个吸收池，而且以试液本身对某一波长的光的吸光度为参比，因此消除了因试液与参比液及两个吸收池之间的差异所引起的测量误差，从而提高了测量的准确度。

通过光学系统转换，可使双波长分光光度很方便地转化为单波长工作方式。如果能在λ1和λ2处分别记录吸光度随时间变化的曲线，还能进行化学反应动力学研究。而且，测量时使用同一吸收池，不用空白溶液作参比，可消除参比池的不同和制备空白溶液等产生的误差。此外，使用同一光源来获得两束单色光，减小了由光源电压变化而产生的误差。所以对于多组分混合物、浑浊试样（如生物组织液）分析，以及存在背景干扰或共存组分吸收干扰的情况下，利用双波长分光光度法往往能提高方法的灵敏度和选择性。

3.紫外―可见分光光度法的应用

紫外―可见分光光度法不仅可以用来对物质进行定性分析及结构分析，而且可以进行定量分析及测定某些化合物的物理化学数据等，例如相对分子质量、配合物的配位比及稳定常数和解离常数等。

在有机化合物的定性鉴定和结构分析中，由于紫外―可见光区的吸收光谱比较简单，特征性不强，并且大多数简单官能团在近紫外光区只有微弱吸收或者无吸收，因此，该方法的应用也有一定的局限性。但它可用于鉴定共轭生色团，以此推断未知物的结构骨架。在配合红外光谱、核磁共振谱等进行定性鉴定及结构分析中，它仍不失为一种十分有用的辅助方法。

利用紫外―可见分光光度法确定未知不饱和化合物结构的结构骨架时，一般有两种定性方法。

①比较法（比较吸收曲线）。所谓比较法是在相同的测定条件下，比较未知物与已知标准物的吸收曲线，如果它们的吸收曲线完全相同，则可以认为待测试样与已知化合物有相同的生色团。吸收曲线的形状、吸收峰的数目以及最大吸收波长的位置和相应的摩尔吸光系数，是进行定性鉴定的依据。其中，最大吸收波长λmax及相应的εmax是定性鉴定的主要参数。

②用经验规则计算最大吸收波长，然后与实测值比较。当采用物理和化学方法判断某化合物的几种可能结构时，可用经验规则计算最大吸收波长λmax并与实测值进行比较，然后确认物质的结构。Woodward和Fieser总结了许多资料，对共轭分子的最大吸收波长提出了一些经验规律，据此可对一些共轭分子的最大吸收波长值进行计算，这对分子结构的推断是有参考价值的。(www.xing528.com)

（1）结构分析。采用紫外光谱法，还可以确定一些化合物的构型和构象。一般来说，顺式异构体的最大吸收波长λmax和摩尔吸光系数εmax都比反式异构体小，因此有可能用紫外光谱法进行区别。例如，在顺式肉桂酸和反式肉桂酸中，顺式的空间位阻大，苯环与侧链双键共平面性差，不易产生共轭；反式则空间位阻小，双键与苯环在同一平面上，容易产生共振。因而，反式的最大吸收波长λmax（295nm）和摩尔吸光系数εmax（27 000L·mol―1·cm―1）要大于顺式的最大吸收波长λmax（280nm）和摩尔吸光系数εmax（13 500L·mol―1·cm―1）。利用紫外光谱法，还可以测定某些化合物的互变异构现象。一般来说，共轭体系的λmax和εmax要大于非共轭体系。例如，乙酰乙酸乙酯的酮式和烯醇式间的互变异构。在极性溶剂中该化合物以酮式存在，吸收峰弱；在非极性溶剂（如正己烷）中该化合物以烯醇式为主，吸收峰较强。表5―2列出了一些有机化合物的互变异构体的λmax（εmax）。

表5―2　某些有机化合物的互变异构体的λmax和εmax

（2）定量分析。紫外―可见分光光度法是进行定量分析的最有用的工具之一。它不仅可以对那些本身在紫外―可见光区有吸收的无机和有机化合物进行定量分析，而且可以利用许多试剂可与非吸收物质反应产生在紫外和可见光区有强烈吸收的产物，即“显色反应”，进而对非吸收物质进行定量测定。该法灵敏度可达10―6～10―7mol·L―1，准确度也较高，相对误差为1%～3%。如果操作得当，误差往往可以更低；而且操作容易、简单。

紫外―可见分光光度法定量分析的依据是Lambert―Beer定律，即物质在一定波长处的吸光度与它的浓度呈线性关系。因此，通过测定溶液对一定波长入射光的吸光度，就可求出溶液中物质浓度和含量。由于最大吸收波长λmax处的摩尔吸光系数εmax最大，所以通常都是测量λmax的吸光度，以获得最大灵敏度。同时，吸收曲线在最大吸收波长处常常是平坦的，使所得数据能更好地符合Beer定律。

①单组分定量分析

a.校正曲线法。这是实际工作中用得最多的一种方法。具体做法是：配制一系列不同浓度的标准溶液，以不含被测组分的空白溶液为参比。在相同条件下测定标准溶液的吸光度，绘制吸光度—浓度曲线，这种曲线就是校正曲线（calibration curve），又称标准曲线（standard curve）。在相同条件下测定未知试样的吸光度，从校正曲线上就可以找到与之对应的未知试样的浓度。当测试样品较多时，利用校正曲线法比较方便，而且误差较小。

b.比较法。比较法是先配制与被测试液浓度相近的标准溶液，使标准溶液（cs）和被测试液（cx）在相同条件下显色后，测其相应的吸光度As和Ax，根据Lambert―Beer定律有

As=εbcs；Ax=εbcx

两式相比再整理得

这种方法比较简便，但应当注意，只有当cx与cs相近时，利用该式计算的结果才可靠，否则将有较大误差。

②多组分定量分析

根据吸光度具有加合性的特点，在同一试样中可以测定两个以上的组分。假设试样中含有x和y两种组分，在一定条件下将它们转化为有色化合物，分别绘制其吸收光谱，会出现如图5―24所示的三种情况。

a.图5―24（a）的情况是光谱不重叠，或至少可能找到某一波长处x有吸收而y不吸收，在另一波长处y吸收而x不吸收。则可分别在波长λ1和λ2时，测定组分x和y而相互不产生干扰，即测定方法与单组分相似。

b.图5―24（b）的情况是光谱部分重叠，组分x对组分y的光度测定有干扰，但组分y对组分x无干扰。这时可以先在λ1处测量溶液的吸光度A1，并求得x组分的浓度。然后再在λ2处测量溶液的吸光度A2，根据吸光度的加合性原则，可列出下式

式中，εx，2、εy，2分别为x和y在波长λ2时的摩尔吸光系数，可用纯组分x和y的标准溶液在波长λ2处测得。由式（5―18）即可求得组分y的浓度cy。

c.图5―24（c）的情况是吸收光谱相互重叠，表明两组分彼此相互干扰。可找出两个波长，在该波长下，两组分的吸光度差值ΔA较大。在波长为λ1和λ2处分别测定吸光度A1和A2，由吸光度的加合性得联立方程

图5―24　多组分吸收光谱

式中，εx，1、εy，1分别为x和y在波长λ1时的摩尔吸光系数，εx，2、εy，2分别为x和y在波长λ2时的摩尔吸光系数，它们可用x和y的标准溶液在两波长处分别测得。解式（5―19）的联立方程可求出cx和cy的值。

原则上对任何数目的组分都可以用此方法建立方程求解，在实际应用中通常仅限于两个或三个组分的体系。如能利用计算机解多元联立方程，则不会受到这种限制。但随着测量组分的增多，实验结果的误差也将增大。当然对于多组分分析，还有导数分光光度法等多种分析方法。

③双波长分光光度法

对于吸收光谱有重叠的单组分（显色剂与有色配合物的吸收光谱重叠）或多组分（两种性质相近的组分所形成的有色配合物吸收光谱重叠）试样、混浊试样以及背景吸收较大的试样，由于存在很强的散射和特征吸收，难以找到一个合适的参比溶液来抵消这种影响。利用双波长分光光度法，使两束不同波长的单色光以一定的时间间隔交替地照射同一吸收池，测量并记录两者吸光度的差值（原理如图5―23所示）。这样就可以从分析波长的信号中扣除来自参比波长的信号，消除上述各种干扰求得被测组分的含量。该法不仅简化了分析过程，还能提高分析方法的灵敏度、选择性及测量的精密度。因此，被广泛用于环境试样及生物试样的分析。

a.单组分的测定。用双波长分光光度法进行定量分析，是以试液本身对第一波长的光的吸光度作为参比，这不仅避免了因试液与参比溶液或两吸收池之间的差异所引起的误差，而且还可以提高测定的灵敏度和选择性。

b.两组分共存时的分别测定。当两种组分（或它们与试剂生成的有色物质）的吸收光谱有重叠时，要测定其中一个组分就必须设法消除另一组分的光吸收。对于相互干扰的双组分体系，它们的吸收光谱重叠，选择参比波长和测定波长的条件是：待测组分在两波长处的吸光度之差ΔA要足够大，干扰组分在两波长处的吸光度应相等，即以等吸收点为参比波长和测定波长。这样用双波长法测得的吸光度差值与待测组分的浓度呈线性关系，而与干扰组分无关，从而消除了干扰。如图5―25所示，M和N组分共存时，其吸收光谱相互重叠。要测定M组分，λ1、λ2、λ3为N组分的等吸收点，λ1和λ2处组分M具有较大的ΔA，因而可选λ2作为测量波长，λ1作为参比波长。

图5―25　用等吸收法选择波长组合

对于λ1，

A1=εM，1bcM+εN，1bcN

对于λ2，

A2=εM，2bcM+εN，2bcN

由双波长光度计测得

可见ΔA与cM成正比，而与cN无关，从而消除了组分N的干扰。同理，可另选两波长测定N组分而M组分不干扰。

c.浑浊试液中组分的测定。浑浊试液中组分的测定在一般分光光度法中必须使用相同浊度的参比溶液，但在实际中很难找到合适的参比溶液。双波长光度法中，参比溶液不是另外的参比溶液，而是试液本身，它只需要用一个比色皿盛装试液，用两束不同波长的光照射试液时，两束光都受到同样的悬浮粒子的散射，当λ1和λ2相距不大时，由同一试样产生的散射可认为大致相等，不影响吸光度差ΔA的值。一般选择待测组分的最大吸收波长λmax为测量波长λ1，选择与λ1相近而两波长相差在40～60nm范围内且又有较大的ΔA值的波长（λ2）为参比波长。