培养基和试剂的重要性及使用注意事项

食品微生物的常规培养检验中，使用多种不同培养基和试剂对微生物进行分离、培养、鉴定、保藏和（或）对各种微生物进行计数。因此，培养基及试剂的质量对保证实验结果的准确性、科学性具有重要的意义。随着科技的进步和发展，培养基和试剂逐步进入商品化、标准化的大规模生产，适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制试验显得尤为重要。因此，国家卫计委依据国内外的相关标准对GB 4789.28进行了编制与修订，并于2013年颁布了《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》（GB 4789.28）。该标准对食品微生物检验中使用的培养基的制备、性能测试方法、质量评价指标作出了量化要求，从而建立了对培养基质量控制的标准流程，为确保食品微生物实验的质量提供必要的保证。

1.培养基及其分类

培养基是指液体、半固体或固体形式的、含天然或合成成分，用于保证微生物繁殖（含或不含某类微生物的抑菌剂）、鉴定或保持其活力的物质。常见培养基的分类和作用如表1-3所示。

2.培养基及试剂质量保证

（1）证明文件。

①生产企业提供的文件。

生产企业应提供以下资料（可提供电子文本）：

——培养基或试剂的各种成分、添加成分名称及产品编号；

——批号；

——最终pH（适用于培养基）；

——储存信息和有效期；

——标准要求及质控报告；

——必要的安全和（或）危害数据。

②产品的交货验收。

对每批产品，应记录接收日期，并检查：

——产品合格证明；

——包装的完整性；

——产品的有效期；

——文件的提供。

（2）贮存。

①一般要求：应严格按照供应商提供的贮存条件、有效期和使用方法进行培养基和试剂的保存和使用。

表1-3　培养基的分类和作用

②脱水合成培养基及其添加成分的质量管理和质量控制：脱水合成培养基一般为粉状或颗粒状形式包装于密闭的容器中。用于微生物选择或鉴定的添加成分通常为冻干物或液体。培养基的购买应有计划，以利于存货的周转（即掌握先购先用的原则）。实验室应保存有效的培养基目录清单，清单应包括以下内容：

——容器密闭性检查；

——记录首次开封日期；

——内容物的感官检查。

开封后的脱水合成培养基，其质量取决于贮存条件。通过观察粉末的流动性、均匀性、结块情况和色泽变化等判断脱水培养基的质量的变化。若发现培养基受潮或物理性状发生明显改变则不应再使用。

③商品化即用型培养基和试剂：应严格按照供应商提供的贮存条件、有效期和使用方法进行保存和使用。

④实验室自制的培养基：在保证其成分不会改变的条件下保存，即避光、干燥保存，必要时在（5±3）℃冰箱中保存，通常建议平板不超过2～4周，瓶装及试管装培养基不超过3至6个月，除非某些标准或实验结果表明保质期比上述的更长。

建议需在培养基中添加的不稳定的添加剂应即配即用，除非某些标准或实验结果表明保质期更长；含有活性化学物质或不稳定性成分的固体培养基也应即配即用，不可二次融化。

培养基的贮存应建立经验证的有效期。观察培养基是否有颜色变化、蒸发（脱水）或微生物生长的情况，当培养基发生这类变化时，应禁止使用。

培养基使用或再次加热前，应先取出平衡至室温。

（3）培养基的实验室制备。

①一般要求。

正确制备培养基是微生物检验的最基础步骤之一，使用脱水培养基和其他成分，尤其是含有有毒物质（如胆盐或其他选择剂）的成分时，应遵守良好实验室规范和生产厂商提供的使用说明。培养基的不正确制备会导致培养基出现质量问题。

使用商品化脱水合成培养基制备培养基时，应严格按照厂商提供的使用说明配制。如重量（体积）、pH、制备日期、灭菌条件和操作步骤等。

实验室使用各种基础成分制备培养基时，应按照配方准确配制，并记录相关信息，如：培养基名称和类型及试剂级别、每个成分物质含量、制造商、批号、pH、培养基体积（分装体积）、无菌措施（包括实施的方式、温度及时间）、配置日期、人员等，以便溯源。(www.xing528.com)

②水。

实验用水的电导率在25℃时不应超过25μS/cm（相当于电阻率≥0.4 MΩcm），除非另有规定要求。水的微生物污染不应超过103CFU/mL。应按GB 4789.2，采用平板计数琼脂培养基，在（36±1）℃培养（48±2）h进行定期检查微生物污染。

③称重和溶解。

小心称量所需量的脱水合成培养基（必要时佩戴口罩或在通风柜中操作，以防吸入含有有毒物质的培养基粉末），先加入适量的水，充分混合（注意避免培养基结块），然后加水至所需的量后适当加热，并重复或连续搅拌使其快速分散，必要时应完全溶解。含琼脂的培养基在加热前应浸泡几分钟。

④pH的测定和调整。

用pH计测pH，必要时在灭菌前进行调整，除特殊说明外，培养基灭菌后冷却至25℃时，pH应在标准pH±0.2范围内。一般使用浓度约为40g/L（约1mol/L）的氢氧化钠溶液或浓度约为36.5g/L（约1mol/L）的盐酸溶液调整培养基的pH。如需灭菌后进行调整，则使用灭菌或除菌的溶液。

⑤分装。

将配好的培养基分装到适当的容器中，容器的体积应比培养基体积最少大20%。

⑥灭菌。

A.一般要求。

培养基应采用湿热灭菌法或过滤除菌法。

某些培养基不能或不需要高压灭菌，可采用煮沸灭菌，如SC肉汤等特定的培养基中含有对光和热敏感的物质，煮沸后应迅速冷却，避光保存；有些试剂则不需灭菌，可直接使用。

B.湿热灭菌。

湿热灭菌在高压锅或培养基制备器中进行，高压灭菌一般采用（121±3）℃灭菌15min，具体培养基按食品微生物学检验标准中的规定进行灭菌。培养基体积不应超过1000mL，否则灭菌时可能会造成过度加热。所有的操作应按照标准或使用说明的规定进行。

灭菌效果的控制是关键问题。加热后采用适当的方式冷却，以防加热过度。这对于大容量和敏感培养基十分重要，例如含有煌绿的培养基。

C.过滤除菌。

过滤除菌可在真空或加压的条件下进行。使用孔径为0.2μm的无菌设备和滤膜。消毒过滤设备的各个部分或使用预先消毒的设备。一些滤膜上附着有蛋白质或其他物质（如抗生素），为了达到有效过滤，应事先将滤膜用无菌水润湿。

D.检查。

应对经湿热灭菌或过滤除菌的培养基进行检查，尤其要对pH、色泽、灭菌效果和均匀度等指标进行检查。

E.添加成分的制备。

制备含有有毒物质的添加成分（尤其是抗生素）时应小心操作（必要时在通风柜中操作），避免因粉尘的扩散造成实验人员过敏或发生其他不良反应；制备溶液时应按产品使用说明操作。不要使用过期的添加剂；抗生素工作溶液应现用现配；批量配制的抗生素溶液可分装后冷冻贮存，但解冻后的贮存溶液不能再次冷冻；厂商应提供冷冻对抗生素活性影响的有关资料，也可由使用者自行测定。

（4）培养基的使用。

①琼脂培养基的融化。

将培养基放到沸水浴中或采用有相同效果的方法（如高压锅中的层流蒸汽）使之融化。经过高压的培养基应尽量减少重新加热时间，融化后避免过度加热。融化后应短暂置于室温中（如2min）以避免玻璃瓶破碎。

融化后的培养基放入47～50℃的恒温水浴锅中冷却保温（可根据实际培养基凝固温度适当提高水浴锅温度），直至使用，培养基达到47～50℃的时间与培养基的品种、体积、数量有关。融化后的培养基应尽快使用，放置时间一般不应超过4h。未用完的培养基不能重新凝固留待下次使用。敏感的培养基尤应注意，融化后保温时间应尽量缩短，如有特定要求可参考指定的标准。倾注到样品中的培养基温度应控制在约45℃左右。

②培养基的脱氧。

必要时，将培养基在使用前放到沸水浴或蒸汽浴中加热15min；加热时松开容器的盖子；加热后盖紧，并迅速冷却至使用温度（如FT培养基）。

③添加成分的加入。

对热不稳定的添加成分应在培养基冷却至47～50℃时再加入。无菌的添加成分在加入前应先放置到室温，避免冷的液体造成琼脂凝结或形成片状物。将加入添加成分的培养基缓慢充分混匀，尽快分装到待用的容器中。

④平板的制备和储存。

倾注融化的培养基到平皿中，使之在平皿中形成厚度至少为3mm（直径90mm的平皿，通常要加入18～20mL琼脂培养基）。将平皿盖好皿盖后放到水平平面使琼脂冷却凝固。如果平板需储存，或者培养时间超过48h或培养温度高于40℃，则需要倾注更多的培养基。凝固后的培养基应立即使用或存放于暗处和（或）（5±3）℃冰箱的密封袋中，以防止培养基成分的改变。在平板底部或侧边做好标记，标记的内容包括名称、制备日期和（或）有效期。也可使用适宜的培养基编码系统进行标记。

将倒好的平板放在密封的袋子中冷藏保存可延长储存期限。为了避免冷凝水的产生，平板应冷却后再装入袋中。储存前不要对培养基表面进行干燥处理。

对于采用表面接种形式培养的固体培养基，应先对琼脂表面进行干燥：揭开平皿盖，将平板倒扣于烘箱或培养箱中（温度设为25～50℃）；或放在有对流的无菌净化台中，直到培养基表面的水滴消失为止。注意不要过度干燥。商品化的平板琼脂培养基应按照厂商提供的说明使用。

（5）培养基的弃置。

所有污染和未使用的培养基的弃置应采用安全的方式，并且要符合相关法律法规的规定。

3.培养基和试剂的其他内容

参考GB 4789.28。