生物质及生物质炭形貌分析的方法优化

1.光学显微镜观测法

光学显微镜的成像原理是以光为介质，可见光照射在物体表面，通过局部散射或反射来形成不同对比，然后对被物体调制后的信息进行解调便可获得物体空间信息。光学显微镜可分为传统光学显微镜和近场光学显微镜。

传统光学显微镜主要包含物镜、目镜、聚光器和光源，通过物镜和目镜实现放大观察。由于传统光学显微镜分辨率受光的波长λ及数值孔径nsinθ等参数的限制，一般只能达到0.1μm，因此传统光学显微镜主要用于分析生物质及其热转化所得生物质炭的整体形貌，包括孔隙、微米尺度组织及结构交联和分布特性。此外，在岩相学中应用较为广泛的岩相分析仪也逐渐用于对生物质炭的形貌和结构进行分析。岩相分析仪除可观察样品的组织形貌外，还可检测样品的反射率。由于生物质炭的反射率会随热解程度的增加而增加，因此反射率也可作为评判生物质炭热解程度及反应性的一个重要指标，受到了越来越多研究者的关注。图9-9所示是岩相分析仪下典型的生物质炭的形貌图。

近场光学显微镜是对远场光学显微镜的革命性发展，其主要由局域光源、激光器、光纤探针样品台、光学放大系统组成。近场光学显微镜的工作方式是从近场区的电磁场（隐失场）获取小于波长的超分辨极限的精细结构和起伏的信息，然后再将含该信息的隐失场变换为可进行能量输送的传播场，使放在远处的探测场和成像器件可以接收到隐含在隐失场中的超分辨信息，从而进行测量。

图9-9　岩相分析仪下典型的生物质炭的形貌图

近场光学显微镜的工作原理是，当发生光的衍射现象时，利用光的可逆性，即在光的传播方向反转时，光将沿入射的路径逆向传播。因此，当用含有超分辨信息的隐失波照射具有小于波长的精细结构或空间起伏的物体，如光栅、小孔时，这些光栅或小孔可把隐失波转换成含有超分辨信息的传导波，为远处探测器所接收。它的核心部件是近场探测的小孔装置，常用的探针有小孔探针、无孔探针、等离子激元探针。近场光学显微镜的特点是样品照明和样品收集这两者必须至少有一个工作在近场，而传统光学显微镜的这两者都工作在远场；近场光学显微镜采取的是网络状扫描成像方法。常用的近场光学显微镜有扫描隧道显微镜和原子力显微镜（AFM）。

目前，原子力显微镜由于仪器价格相对适中，分辨率可达纳米级，比光学衍射极限高1000倍以上，因此在纳米材料的结构检测中应用广泛。其与传统光学显微镜和电子显微镜等的主要区别在于，原子力显微镜不使用透镜或光束照射，因此，它不会因衍射和像差而受到空间分辨率的限制，并且不需要准备用于引导光束和对样品染色的空间，使用上较为灵活。原子力显微镜也引起了学者们的注意，并逐渐应用在生物质研究中。图9-10所示是原子力显微镜下观察到的典型生物质的二维及三维形貌图。

2.电子显微镜观测法

电子显微镜的成像原理是电子光学原理，以电子束为介质，用电子束和电子透镜代替传统的光束和光学透镜。电子显微镜是利用电磁场偏折、聚焦电子及电子与物质作用所产生散射之原理来研究物质构造及细微结构的精密仪器。由德布罗意的波动理论λe=h/mv=h/（2qmv）1/2，可以看出电子束的波长仅与加速的电压有关（电子束的电量及质量为固定值）。根据瑞利准则（当不相干光照明时，s=0.61λ/（nsinθ）=0.61λ/NA；当相干光照明时，s=0.77λ/（nsinθ）=0.77λ/NA），可以得出电子束的波长变化直接影响显微镜的分辨能力。德布罗意的波动理论使人们发现，光的波长是可变的，电子显微镜也由此而产生，使得显微镜的解析度和放大倍数实现了数量级的飞跃。电子显微镜的构造与光学显微镜的相似，由聚光镜、物镜和投影镜（目镜）三部分组成。电子显微镜按结构和用途可分为透射电子显微镜、扫描电子显微镜、反射电子显微镜和发射电子显微镜等。

图9-10　原子力显微镜下典型生物质的二维及三维形貌图

扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）通过聚焦电子束扫描表面来产生样品的图像。SEM主要工作过程如下：从电子枪发出的电子束经过聚束镜、偏转线圈和物镜后，照射到样品上，将表面产生的信号（二次电子、背向反射电子、吸收电子、X射线等）收集并放大处理后，输入同步扫描的阴极射线管，从而显示出试样形貌。由于扫描电子显微镜采用电子束在样品上扫描，所以必须先将样品进行固定处理。为了避免电子束在照射到样品表面之前与残留的气体分子相撞，扫描电子显微镜必须保持在一定的高真空环境下工作，因此样品需要进行脱水和临界点干燥等预处理。因为有些样品属于非导电性的，电荷累积在其表面就要产生排斥力，使电子束受到干扰，导致扫描结果不准确，甚至无法进行扫描观察，同时，由于电子束对样品进行扫描时，入射的电子会把入射的部分能量转化为热能，使样品表面及亚表面层的温度升高，因此，为了避免样品在电子束扫描时因高温而遭破坏及增加二次电子的产生，从而得到更加清晰的影像，必须在样品的表面覆盖一层金属或碳薄膜。SEM的分辨率受到入射电子束所能获得的最小光斑尺寸的限制。目前SEM分辨率一般被限制在5 nm左右。大量研究者通过SEM观察了热反应前后生物质样品的形态变化。图9-11所示是SEM下典型的生物质形貌图。一般的光学显微镜可用来观察所选区域形态类型组成和大孔隙度，而超细结构及其细节可用扫描电子显微镜进行定性和定量研究。值得指出的是，SEM定量分析目前仍然非常耗时，需要进一步开发快速定量检测技术，提高其分析效率及准确度。

环境扫描电子显微镜（enviromental scanning electron microscope，ESEM）是SEM的一种变体，其主要采用气体放大原理，克服了SEM需要在高真空条件下工作和需要导电涂层的缺点。此外，ESEM允许在不进行样品预处理的情况下对湿体系进行成像分析。因此，ESEM可以对生物质样品和热解产物在自然状态下进行成像分析，扩大了SEM的应用领域。图9-12所示为ESEM下典型的生物质炭形貌图。(www.xing528.com)

扫描电子显微镜与能量色散X射线光谱仪联用（SEM/EDX），可实现微观结构和化学组分的同时监测。近年来，在SEM基础上发展起来的计算机控制扫描电子显微镜（CCSEM），由于可在计算机控制下对多个颗粒进行程序化分析，也逐渐受到研究者的重视。CCSEM由扫描仪器与计算机控制的数据采集和收集系统组成。CCSEM主要用于确定样品中颗粒的大小、数量、分布和半定量组成以及元素间的缔合关系。

图9-11　SEM下典型的生物质形貌图（放大300倍）

图9-12　ESEM下典型的生物质炭形貌图（第二行为第一行的局部放大图）

另一种使用广泛的电子显微镜为透射电子显微镜（TEM），其成像原理为：电子束透过样品后经过电磁透镜的聚焦与放大，所产生的物像投射到荧光屏上或照相底片上，从而得到高倍率的放大图像。它的电子枪在镜筒的顶部，电子束由钨丝热阴极发射，通过第一、第二聚光镜聚焦。电子束通过样品后由物镜成像于中间镜，再通过中间镜和投影镜逐级放大，成像于荧光屏或照相底片。中间镜主要通过对励磁电流的调节，使放大倍数从几十倍连续地变化到几十万倍；改变中间镜的焦距，即可在同一样品的微小部位上得到电子显微像和电子衍射图像。透射电子显微镜的解像能力及仪器的整体性能主要由电子枪决定。电子枪主要由阴极和阳极组成，阴极（灯丝）作为电子源，阳极则用来加速电子束。由于电子束易散射或被物体吸收，其穿透力低，因此必须制备超薄样品切片（通常厚度为50～100 nm）方可检测。由于电子束在样品内部的展宽几乎可以忽略，使用带有场发射源的现代TEM仪器时，其分辨率可以达到1 nm。近年来，在TEM的基础上发展起来的高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）发展迅猛，其分辨率已经达到原子级别（几埃，甚至零点几埃），理论上能够看清一个一个的原子。所以HRTEM用来观测晶体内部结构、原子排布以及很多精细结构（比如位错、孪晶等），目前也有部分研究者采用HRTEM分析生物质高温下所得生物质炭中的芳香环、石墨微晶等结构。高分辨像是相位衬度像，是所有参加成像的衍射束与透射束之间因相位差而形成的干涉图像。普通TEM要么采用透射电子，要么采用散射电子，HRTEM两者都用。而使用的电子类别越多，对样品的要求就越高，就必须保证样品足够薄。图9-13所示为TEM下典型的生物质炭形貌图。

图9-13　TEM下典型的生物质炭形貌图

扫描透射电子显微镜（STEM）则使用SEM的扫描式检测模式，将电子束聚焦后针对每个点进行扫描透射检测。STEM兼具SEM和TEM的功能，故能用来检测样品的表面结构，并可进行微区线扫描。此外，STEM不仅能看到原子，提供影像，还可以通过对电子显微镜和电子绕射圆形的计算分析，得到理论上的结论。

当前研究者们已利用电子显微镜对生物质及其热转化过程中的生物质炭形貌和截面进行了广泛的研究，提供了生物质及生物质炭的粒度、转化过程中颗粒溶胀行为、孔隙结构、元素组成等重要信息。

3.电子探针显微分析（EPMA）法

电子探针是一种利用电子束作用于样品后产生的特征X射线进行微区成分分析的仪器，可以用来分析样品微区的化学组成。EPMA法可实现除H、He、Li、Be等几个较轻元素和U以后的元素外其他元素的定性和定量分析。EPMA法以经过加速和聚焦的极窄的电子束为探针，激发试样中某一微小区域，使其发出特征X射线，测定该X射线的波长和强度，即可对该微区的元素进行定性或定量分析。电子探针的电子柱和基本仪器与SEM的非常相似。EPMA法与SEM的主要区别在于，SEM通过表面的视觉放大来描述表面形貌，而EPMA法能够分析样品的化学成分。扫描电子显微镜在配备X射线光谱仪时（SEMEDS），可以实现与EPMA法相同的功能。EPMA法在空间上可实现数个立方微米内元素的成分分析，可直接对大块试样中的微小区域进行分析。图9-14所示为EPMA法对生物质炭颗粒的31P成像分析。

图9-14　EPMA法对生物质炭颗粒的31P成像分析