色谱分析法介绍与应用

色谱分析法，又称层析法、色层法、层离法，是一种物理或物理化学分离分析方法。色谱分析法先将混合物中各组分分离，而后逐个进行分析。如前所述，其分离原理是利用混合物中各组分在固定相和流动相中溶解、解析、吸附、脱附或其他亲和作用性能的微小差异，当两相做相对运动时，使各组分随着移动在两相中反复受到上述各种作用而实现分离。色谱法已成为分离分析各种复杂混合物的重要方法。1984年，Freedman等人首次提出色谱分析法，他们用薄层色谱和火焰离子化检测器（TLC/FID）对油脂的酯交换反应进行了分析。此外，他们还采用TLC/FID将甘油含量与气相色谱法测定的酰基转化进行关联分析。气相色谱和高效液相色谱的结合分析技术也被用于生物油的分析。当前，已发展出了多种不同的色谱分析技术对生物油进行分析表征，下面分别进行介绍。

1.气相色谱法

气相色谱（GC）是最常规的色谱分析技术，已有研究将其用于分析酯交换反应过程的来源（油或甘油三酯）和产物（生物柴油）中的脂肪酸和烷基酯含量，还有研究将其用于在线测定反应过程中形成的化合物来估计生物油的毒性。此外，还可采用气相色谱法评价生物油的单不饱和脂肪酸、双不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸组成以及多不饱和脂肪酸（PUFA）含量。使用GC也可测量油中各个组分的含量百分数。一种典型的生物油GC图谱如图9-2所示。

Maulidiyah等人利用单个化合物随保留时间的特性变化，分析了烷基酯的组成单元。烷基酯的质谱电离碎片谱图由特定暴露能量水平下分子离子的符号m/z值来测量和记录。Montpetit和Tremblay利用GC鉴定未转运的甾体化合物，对生物柴油转化最终产品成分的选择性进行了鉴定；在另一项研究中，他们使用了气相色谱结合火焰电离检测器（GCFID）的方法对已识别的非交叉甾体化合物（甾体糖苷类）中所选离子进行了监测。利用色谱技术在色谱峰范围内的保留时间和所选化合物的Kovats（科瓦茨）指数特征，也可以鉴定色谱中未解析的峰。它说明了减少分析时间、完全分离、同时鉴定化合物和可靠测定化合物的重要性。因此，它成为测定含柴油等混合燃料成分的重要分析方法。气相色谱结合同位素稀释质谱（GC-IDMS）方法与GC-FID方法相似，可用于微量元素的鉴定。研究者们通过线性度、运行范围和相应的响应因子，验证了GC-IDMS方法的运行特性。研究人员对过程的检测极限、过程的量化极限、量化的精度、数据的可靠性、数据的不确定性和过程的鲁棒性进行了检验，这些特性使得GC-IDMS方法成为测定生物油中化合物的良好方法。

图9-2　典型的生物油GC图谱

一维气相色谱与质谱联用（GC-MS）是鉴别挥发性高、沸点低和分子量小的化合物的常用方法。根据质谱鉴定结果，可以采用内标法和外标法对部分化合物进行定量分析。外标法通过绘制不同标准品的浓度曲线，能够较好地鉴别样品，但由于标准样品的缺乏，外标法往往受到限制。内标法是指以纯物质为内标计算每种化合物的含量，适用于没有标准样品的化合物检测。复杂生物油气相色谱分析还存在一系列难题，如色谱分辨率不足、色谱峰共洗脱、质谱分析中某些生物油组分的质谱不可用、分析标准缺乏等。研究表明，气相色谱法只能检测到生物油中约40%的组分和不到25%的高分子量化合物。

2.液相色谱法

液相色谱法是用液体作为流动相的色谱法。1906年，俄国植物学家茨维特（M.S.Tswett）将植物色素提取液加到装有碳酸钙微粒的玻璃柱子上部，继而以石油醚淋洗柱子，结果使不同的色素在柱中分离，从而形成不同颜色的谱带，每个色带代表不同的色素。液相色谱法不能由色谱图直接给出未知物的定性结果，而必须由已知标准作对照定性。当无纯物质对照时，定性鉴定就很困难，这时需要借助质谱法、红外法和化学法等的配合。另外，大多数金属盐类和热稳定性差的物质还不能用液相色谱法分析，而要使用高效液相色谱法。根据固定相的不同，液相色谱法分为液固色谱法、液液色谱法和键合相色谱法。应用最广的是以硅胶为填料的液固色谱法和以微硅胶为基质的键合相色谱法。根据固定相的形式，液相色谱法可分为柱色谱法、纸色谱法及薄层色谱法。根据吸附力，液相色谱法可分为吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法和凝胶渗透色谱法。近年来，在液相柱色谱系统中加上高压液流系统，使流动相在高压下快速流动，以提高分离效果，因此出现了高效（又称高压）液相色谱法。

高效液相色谱-紫外检测器（HPLC-UV）还可用于生物柴油酯交换过程的在线监测，可以时间为函数变量来监测。HPLC-UV在核壳柱上快速洗脱，节省了时间和试剂。由于HPLC分析不需要衍生化，因此使用高效液相色谱在线监测生物柴油生产比气相色谱过程有效。油转化为相应的烷基酯，也可用HPLC-UV进行测定。HPLC-UV可测定生物柴油中单甘油酯、双甘油酯、甘油三酯、甲酯和游离脂肪酸的含量。高效液相色谱法可用于估算生物柴油中未加工的游离脂肪酸、脂肪酸烷基酯（生物柴油）、甘油、甘油磷酸和溶血磷酸酯的含量。带紫外检测器的反相高效液相色谱法可用于分析生物柴油中的污染物生育酚的含量。生物柴油中残留的油菜素类固醇也可用高效液相色谱法进行量化。定量是通过对化合物的选择性标记进行的。这种估算方法对衍生品具有选择性和敏感性。采用高效液相色谱结合质谱（HPLC-MS）分析超微颗粒的代谢情况，可研究颗粒的基本分子活动，也可监测所选择的反应，是分析化学反应过程的有效分析方法。部分研究者还采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）和HPLC-UV对混合燃料进行测定。HPLC-UV无法分析与生物柴油混合的汽油柴油。而HPLC-ELSD可以对共混物中甘油三酯、脂肪酸烷基酯和石油柴油的含量进行鉴别和分析。因此，HPLC-ELSD被证明比HPLC-UV更好。高效液相色谱-折射率检测器（HPLC-RID）可用于对酯交换反应过程中的脂肪酸烷基酯进行分离和测定。该产品性能可靠，噪声小，系统运行稳定。

一种典型的生物油液相色谱图如图9-3所示。

图9-3　典型的生物油液相色谱图（图中1～8等不同信号代表不同组分）

3.凝胶渗透色谱法

凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）是液相色谱中较新的分离技术之一。GPC利用多孔性物质按分子体积大小对检测样品进行分离。Mc Bain用人造沸石成功分离了气体和低分子量的有机化合物。1953年，Wheaton和Bauman用离子交换树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其他非离子物质。1959年，Porath和Flodin用交联的缩聚葡糖制成凝胶，分离水溶液中不同分子量的样品。而对于有机溶剂体系的凝胶渗透色谱来说，首先需要解决的问题是制备适用于有机溶剂的凝胶。20世纪60年代，J.C.Moore在总结前人经验的基础上，结合大网状结构离子交换树脂制备的经验，将高交联度聚苯乙烯凝胶用作柱填料，同时配以连续式高灵敏度的示差折光仪，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱技术。

由于生物油是复杂的大分子混合物，单一的分子量数据难以全面给出生物油的组分信息。当前，在生物油中组分的分子量分布（多分散性指数）成为研究者关注的热点后，传统的色谱法不能同时测定生物油的分子量及其分布，难以满足研究者的需要。凝胶渗透色谱的应用改善了测试条件，并提供了可以同时测定聚合物的分子量及其分布的方法，使其成为测定高分子分子量及其分布的最常用、快速和有效技术。一种典型的生物油凝胶渗透色谱图如图9-4所示，可以看出，凝胶渗透色谱技术可以获得不同生物油中不同分子量组分含量的差异化分布特性。(www.xing528.com)

图9-4　一种典型的生物油凝胶渗透色谱图

4.尺寸排阻色谱法

尺寸排阻色谱法（size exclusion chromatography，SEC）是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。体积大的分子因不能渗透到凝胶孔穴中而被排阻，较早地淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透，最后洗出色谱柱。样品分子基本按其分子大小先后排阻，从柱中流出。SEC被广泛应用于大分子分级，即用来分析大分子物质分子量的分布。SEC可用于从酯交换反应产生的最终产品（生物柴油）混合物中分离甘油和脂肪酸。它可分离脂肪酸烷基酯、甘油、单甘油酯、双甘油酯和甘油三酯，并估计其含量。高压SEC（HPSEC）也被用于分析生物柴油的脂肪酸含量。尺寸排阻高压液相色谱（SE-HPLC）也用于测定生物柴油的脂肪酸含量。它以聚苯乙烯为标准，测定生物柴油中聚合物的含量。SEHPLC与RID联合，可用于鉴定烷基酯中的甘油含量。SEC结合ELSD（SEC-ELSD）可用于估算酯交换反应中最终产品（生物柴油）的游离脂肪酸、单甘油酯、双甘油酯和甘油三酯含量。SEC的主要缺点是缺乏对生物柴油混合物中单个甘油的量化。

5.超临界流体色谱法

超临界流体色谱法（supercritical fluid chromatography，SFC）是一种使用超临界流体作为流动相的色谱方法，其分离能力超过高效液相色谱的，同时使用的流动相也更加绿色环保，常用于分离和检测手性化合物和大分子聚合物。超临界流体色谱兼有气相色谱和液相色谱的特点。它既可分析气相色谱不适用的高沸点、低挥发性样品，又比高效液相色谱具有更快的分析速度和更好的分析条件。其操作温度主要决定于所选用的流体，常用的流体有二氧化碳及氧化亚氮。超临界流体容易控制和调节，在进入检测器前可以转化为气体、液体或保持其超临界状态，因此可与现有任何液相或气相检测器相连接，能与多种类型检测器相匹配，扩大了它的应用范围和分类能力，在定性、定量方面有较大的选择范围。其色谱条件可以用多种梯度技术来优化。超临界流体色谱法比高效液相色谱法更易达到较高的柱效率。

我们知道，物质可以在液态和气态之间相互转换，即可以通过改变物质所受的压力和温度来使物质形态发生改变。某些纯物质在高于其临界压力和临界温度时会呈现出一种特殊的状态，处于这种状态下的物质称为超临界流体，它具有气体的低黏度、液体的高密度以及介于气、液之间较高的扩散系数等特征。超临界流体色谱法正是利用物质在超临界状态的特性而进行分离和检测的，主要具有以下特点：

（1）采用低黏度的超临界流体作为流动相，可以设置高于液相色谱法的流速，使分离速度更快，效率更高；

（2）由于超临界流体的扩散系数介于气体和液体之间，所以峰展宽相比气体流动相更小；

（3）不同压力下对样品的溶解能力不同，样品溶解度随超临界流体的密度增加而增加；

（4）超临界流体色谱法最常用的流动相是超临界二氧化碳流体，相比于常见的液相流动相，其具有安全性好、成本低、在190 nm以上无紫外吸收和更加绿色环保等优点。

6.薄层色谱法

薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）是将固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片，形成一均匀薄层，待点样、展开后，根据比移值（Rf）与由适宜的对照物按同法所得的色谱图的比移值（Rf）的对比，也就是薄层色谱法中原点到斑点中心的距离与原点到溶剂前沿的距离的比值，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。薄层色谱法是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验方法，用途广泛。

薄层色谱法是一种吸附薄层色谱分离法，它利用各成分对同一吸附剂吸附能力的差异，使在流动相（溶剂）流过固定相（吸附剂）的过程中，连续发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而达到各成分互相分离的目的。

薄层层析可根据作为固定相的支持物的不同，分为薄层吸附层析（吸附剂）、薄层分配层析（纤维素）、薄层离子交换层析（离子交换剂）、薄层凝胶层析（分子筛凝胶）等。一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。

物质分子之所以能在固体表面停留，是因为固体表面的分子（离子或原子）和固体内部分子所受的吸引力不相等。在固体内部，分子之间的相互作用力是对称的，其力场互相抵消。而处于固体表面的分子所受的力是不对称的，向内的一面受到固体内部分子的作用力大，而表面层所受的作用力小，因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响，就会被吸引而停留下来。吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸附。在单位时间内吸附于吸附剂的某一表面上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附平衡。吸附层析过程就是不断地产生吸附与解吸附的动态平衡过程。