中性木聚糖酶制剂活力检测

1.实验试剂及仪器

① 柠檬酸溶液（浓度为0.05mol/L）：将1.06g一水柠檬酸溶于80mL中，搅拌，用水定容至100mL。

② 磷酸氢二钠溶液（浓度为0.1mol/L）：将1.42g磷酸氢二钠溶于80mL水中，搅拌，用水定容至100mL。

③ 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液（pH为6.0）：称取7.75g一水柠檬酸和17.93g无水磷酸氢二钠，加水溶解，用水定容至2000mL，测定其pH。如果偏离6.0，用柠檬酸溶液或磷酸氢二钠溶液调节至6.0。

④ 氢氧化钠溶液（浓度为200g/L）：将20.0g氢氧化钠加水溶解，定容至100mL。

⑤ 木糖溶液（浓度为10.0mg/mL）：称取无水木糖1g（精确至0.0001g），加磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液溶解，定容至100mL。

⑥ 木聚糖溶液（浓度为10mg/mL）：称取1.00g木聚糖（Sigma X0627¹），加入0.32g氢氧化钠，再加入90mL水，磁力搅拌，同时缓慢加热（25min），直至木聚糖完全溶解。然后停止加热，继续搅拌30min至室温，测定其pH。如果pH为6.0，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液定容至100mL。如果pH偏离6.0，再用柠檬酸溶液或磷酸氢二钠溶液调节至6.0，然后再用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液定容至100mL。使用前适当摇匀。4℃避光保存，有效期12h。

⑦ DNS试剂：置3，5-二硝基水杨酸3.15g于500mL水中，搅拌3～5s，水浴加热至45℃。然后逐渐加入100mL氢氧化钠溶液（浓度为200g/L），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明。在加入氢氧化钠的过程中，溶液温度不应超过48℃。再逐步加入91.0g四水酒石酸钾钠、2.50g苯酚和2.50g无水亚硫酸钠，继续45℃水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温，用水定容至1000mL，用烧结玻璃过滤器过滤。将滤液贮存于棕色试剂瓶中，于暗处室温下放置7d后使用。有效期60d。

⑧ 仪器与设备：a.分析天平，感量0.0001g；b.pH计，精确至0.01；c.磁力搅拌器：附加热功能；d.电磁振荡器；e.烧结玻璃过滤器，孔径为0.45μm；f.离心机：最大离心加速度不小于2000×g；g.温度计，精度0.1℃；h.恒温水浴锅，温度控制范围在30～80℃之间，精度为0.1℃；i.秒表，每小时误差不超过5s；j.分光光度计，能检测350～800nm的吸光度范围；移液器，精度为1μL。

2.实验步骤

（1）绘制标准曲线

① 吸取磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液2.0mL，加入DNS试剂2.5mL，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至12.5mL，制成标准空白样。

② 分别吸取木糖溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00和7.00mL，分别用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液定容至100mL，配置成浓度为0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60和0.70mg/mL的木糖标准溶液。

③ 分别吸取上述浓度系列的木糖标准溶液各1.00mL（做两个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入水1mL和DNS试剂2.5mL。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至12.5mL。以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度A值。

④ 以木糖浓度为y轴、吸光度A值为x轴，绘制标准曲线。每次新配置DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。

（2）反应用酶液的制备

① 固体样品的反应用酶液制备：称取试样两份，精确至0.0001g。加入100mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液。搅拌30min，再用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液做二次稀释（稀释后的待测酶液中木聚糖酶制剂活力应控制在0.05～0.09U/mL之间）。

② 液体样品的反应用酶液制备：液体试样可直接用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液进行稀释、定容（稀释后的待测酶液中木聚糖酶制剂活力应控制在0.05～0.09U/mL之间）。如果稀释后酶液的pH偏离6.0，需用柠檬酸溶液或磷酸氢二钠溶液调节至6.0，再用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液做适当定容。

（3）测定操作

① 吸取10mL木聚糖溶液，50℃水浴保温平衡5min。

② 吸取10mL经过适当稀释的酶液，50℃水浴保温平衡5min。

③ 吸取1.0mL经过稀释和50℃温度平衡的酶液，加入到刻度试管中，再加入2.5mL DNS试剂，电磁振荡3s，然后加入1.0mL经过50℃温度平衡的木聚糖溶液，50℃保温30min后取出，沸水浴加热5min。用自来水冷却到室温，再用水定容至12.5mL。电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度A_B。

④ 吸取1.0mL经过稀释和50℃温度平衡的酶液，加入到刻度试管中，再加入1.0mL经过50℃温度平衡的木聚糖溶液，电磁振荡3s，50℃精确保温30min，加入2.5mL DNS试剂，电磁振荡3s，以终止酶解反应。沸水浴加热5min。用自来水冷却到室温，再用水定容至12.5mL。电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度A_E。

3.结果计算(www.xing528.com)

试样稀释液中的木聚糖酶制剂活力按式（9-7）或式（9-8）计算：

式中 X_D——稀释酶液中木聚糖酶的活力，U/g [式（9-7）]或U/mL [式（9-8）]

A_E——酶反应液的吸光度

A_B——酶空白样的吸光度

m₀——待测固体酶质量，取值1，g

K——标准曲线的斜率，mg/mL

C——标准曲线的截距，mg/mL

V——测量所用稀释酶液体积，取值1，mL

V₀——待测液体酶体积，取值1，mL

M——木糖的摩尔质量，150.2g/mol

t——酶解反应时间，min

k——单位转化因子，1000μmol/（1mmol）

X_D值应控制在0.05～0.09U/g（或U/mL）之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。

校正后试样稀释液中的木聚糖酶制剂活力按式（9-9）计算：

式中 X——试样中木聚糖酶的活力，U/g或U/mL

D_f——试样的稀释倍数

所得结果表示至整数。

4.注意事项

① 除非另有说明，分析中仅使用分析纯的试剂，水均为符合《GB/T 6682—2008分析实验室用水规格和试验方法》中规定的二级水。

② 处理酸碱和配置DNS试剂时，应在通风橱或通风良好的房间进行，戴上保护眼镜和乳胶手套，一旦皮肤或眼睛接触了上述物质，及时用大量的水冲洗。

③ 木聚糖可以选择其他等效产品。

④ 酶制剂活力的测定应根据应用领域和测试需求来确定最终测试方法和测试条件。例如，饲料添加剂木聚糖酶活力的测定方法中，规定在37℃、pH为5.50的条件下，每分钟从浓度为5mg/mL的木聚糖溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。