羧甲基纤维素酶活力的分析介绍

羧甲基纤维素酶活力英文为Sodium carboxymethylcellulose activity，因此可简写为CMCA。它的定义为：1g固体酶（或1mL液体酶），在（50±0.1）℃、指定pH条件下（酸性纤维素酶pH4.8，中性纤维素酶pH6.0），1h水解羧甲基纤维素钠底物，产生出相当于1mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以U/g（或U/mL）表示。与黏度法的不同之处在于，该法采用35-二硝基水杨酸（英文为3，5-dinitrosalicylic acid，简写为DNS）作为显色试剂，因此还可简写为CMCA-DNS。

1.实验试剂及仪器

① DNS试剂：同滤纸酶活力。

② 柠檬酸缓冲液，0.05mol/L，pH4.8（适用于酸性纤维素酶）：同滤纸酶活力。可用pH4.8乙酸缓冲溶液替代。

③ pH4.8乙酸缓冲溶液：同滤纸酶活力。

④ 磷酸缓冲液，0.1mol/L pH6.0（适用于中性纤维素酶）：同滤纸酶活力。

⑤ 葡萄糖标准贮备溶液（10mg/mL）：同滤纸酶活力。

⑥ 葡萄糖标准使用溶液：同滤纸酶活力。

⑦ 羧甲基纤维素钠（CMC-Na）：化学纯（上海光华化学试剂厂），在25℃，2%水溶液的黏度为800～1200mPa·s，每批羧甲基纤维素钠使用前用标准酶加以校正。

⑧ CMC-Na溶液：称取2g CMC-Na，精确至1mg，缓慢加入约200mL相应的缓冲液，加热至80～90℃，边加热边磁力搅拌，直至CMC-Na全部溶解，冷却后用相应的缓冲液稀释至接近300mL，用2mol/L盐酸或者氢氧化钠调节溶液的pH到（4.8±0.05）（酸性纤维素酶）或（6.0±0.05）（中性纤维素酶），最后定容到300mL，搅拌均匀，贮存于冰箱中备用。

⑨ a.自动连续多挡分配器；b.漩涡混合器；c.试管、水浴等仪器同滤纸酶活力。

2.实验步骤

（1）绘制标准曲线

同滤纸酶活力。

（2）待测酶液的准备

同滤纸酶活力。

（3）样品的测定

① 取4支25mL刻度具塞试管（1支空白管，3支样品管）。(www.xing528.com)

② 分别向4支管中，准确加入2.00mL用相应的pH缓冲溶液配制的CMC-Na溶液。

③ 分别准确加入稀释好的待测酶液0.50mL于3支样品管中（空白管不加），用漩涡混匀器混匀，盖塞。

④ 将4支试管同时置于（50±0.1）℃水浴中，准确计时，反应30min，取出。

⑤ 立即准确地向各管中加入DNS试剂3.0mL。再于空白管中准确加入稀释好的待测酶液0.50mL，摇匀。将4支管同时放入沸水浴中，加热10min，取出，迅速冷却至室温，加水定容至25mL。

⑥ 以空白管（对照液）调仪器零点，在分光光度计波长540nm下，用10mm比色杯，分别测量3支平行管中样液的吸光度，取平均值。以吸光度平均值查标准曲线或用线性回归方程求出还原糖的含量。

3.结果计算

CMCA-DNS酶活力按式（9-3）计算：

或

式中 X₁——样品的羧甲基纤维素（还原糖法）酶活力（CMCA-DNS），U/mL [式（9-3）]或U/g [式（9-4）]

m_A——根据吸光度在标准曲线上查得或计算出的还原糖量，mg

V₀——待测液积酶体积，取值1，mL

V₁——检测用的稀释酶液体积，取值0.5，mL

m——待测固体酶质量，取值1，g

V——稀释酶液总体积，mL

k——时间换算系数，取值2，由60min/30min求得

t——酶反应时间，取值30，min

同一试样两次测试结果的绝对差值，不得超过算术平均值的10%。