滤纸酶活力的测定方法及意义

滤纸酶活力英文为Filter paper activity，因此可简写为FPA。它的定义为：1g固体酶（或1mL液体酶），在（50±0.1）℃、指定pH条件下（酸性纤维素酶pH4.8，中性纤维素酶pH6.0），1h水解滤纸底物，产生出相当于1mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以U/g固体酶（或U/mL液体酶）表示。在碱性、煮沸条件下，3，5-二硝基水杨酸（DNS试剂）与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖（以葡萄糖计）含量成正比。通过在540nm测其吸光度，可得到还原糖的量，进而计算出纤维素酶的活力。

1.实验试剂及仪器

① DNS试剂：置3，5-二硝基水杨酸（10±0.1）g于600mL水中，逐渐加入10g氢氧化钠，在50℃水浴中（磁力）搅拌溶解，再依次加入200g酒石酸钾钠、2g重蒸苯酚和5g无水亚硫酸钠，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000mL，过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。

② 柠檬酸缓冲液，0.05mol/L，pH4.8（适用于酸性纤维素酶）：将4.83g一水柠檬酸溶于约750mL水中，搅拌情况下加入7.94g柠檬酸三钠，用水定容至1000mL。调解溶液pH到（4.8±0.05）备用。可用pH4.8乙酸缓冲溶液替代。

③ pH4.8乙酸缓冲溶液：将8.16g三水乙酸钠溶于约750mL水中，加入2.31mL乙酸，用水定容到1000mL。调解溶液的pH到（4.8±0.05）备用。

④ 磷酸缓冲液，0.1mol/L pH6.0（适用于中性纤维素酶）：分别称取121.0g一水磷酸二氢钠和21.89g二水磷酸氢二钠，将其溶解在10L去离子水中。调解溶液的pH到（6±0.05）备用。溶液在室温下可保存一个月。

⑤ 葡萄糖标准贮备溶液（10mg/mL）：称取于（103±2）℃下烘干至恒重的无水葡萄糖1g，精确至0.1mg，用水溶解并定容至100mL。

⑥ 葡萄糖标准使用溶液：分别吸取葡萄糖标准贮备溶液0.00、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50mL于10mL容量瓶中，用水定容至10mL，盖塞，摇匀备用。系列浓度可以根据需要自行调整。

⑦ 快速定性滤纸（杭州新华一号滤纸）：直径15cm，每批滤纸使用前用标准酶加以校正。

⑧ 除普通实验室仪器外，还应有：a.分光光度计；b.酸度计，精度±0.01pH；c.恒温水浴（50±0.1）℃；d.分析天平，感量0.0001g；e.磁力搅拌器；f.秒表或定时钟；g.沸水浴，可用800W电炉和高脚烧杯、搪瓷量杯或其他容器组成；h.具塞刻度试管，25mL。

2.实验步骤

（1）绘制标准曲线

按表9-1规定的量，分别吸取葡萄糖标准使用溶液、缓冲溶液和DNS试剂于各管中（每管号平行作3个样），混匀。

表9-1 葡萄糖标准曲线

将标准管同时置于沸水浴中，反应10min。取出，迅速冷却至室温，用水定容至25mL，盖塞，混匀。用10mm比色杯，在分光光度计波长540nm处测量吸光度。以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线形回归方程，线形回归系数应在0.9990以上时方可使用（否则须重做）。

（2）待测酶液的准备

称取固体酶样1g（精确至0.0001g）或吸取液体酶样1mL（精确至0.01mL），用水溶解，磁力搅拌混匀，准确稀释定容（使试样液与空白液的吸光度之差恰好落在0.3～0.4范围内），放置10min，待测。

（3）滤纸条的准备

将待用滤纸放入硅胶干燥器中平衡24h，然后制成宽1cm、质量为（50±0.5）mg的滤纸条，放置10min，折成M形，备用。

（4）样品的测定(www.xing528.com)

① 取四支25mL刻度具塞试管（一支空白管，三支样品管）。

② 将折成M形的滤纸条，分别放入每支试管的底部（沿1cm方向竖直放入）。

③ 分别向4支管中，准确加入相应pH的缓冲溶液1.50mL。

④ 分别准确加入稀释好的待测酶液0.50mL于3支样品管中（空白管不加），使管内溶液浸没滤纸，盖塞。

⑤ 将4支试管同时置于（50±0.1）℃水浴中，准确计时，反应60min，取出。

⑥ 立即准确地向各管中加入DNS试剂3.0mL。再于空白管中准确加入稀释好的待测酶液0.50mL，摇匀。将四支管同时放入沸水浴中，加热10min，取出，迅速冷却至室温，加水定容至25mL，摇匀。

⑦ 以空白管（对照液）调仪器零点，在分光光度计波长540nm下，用10mm比色杯，分别测量3支平行管中样液的吸光度，取平均值。以吸光度平均值查标准曲线或用线性回归方程求出还原糖的含量。

3.结果计算

FPA酶活力按式（9-1）或式（9-2）计算：

或

式中 X₁——样品的滤纸酶活力，U/mL [式（9-1）]或U/g [式（9-2）]

t——酶反应时间，取值1，h

m_A——根据吸光度在标准曲线上查得或计算出的还原糖量，mg

V₀——待测液体酶体积，取值1，mL

V₁——检测用的稀释酶液体积，取值0.5，mL

V——稀释酶液总体积，mL

m——待测固体酶质量，取值1，g

同一试样两次测试结果的绝对差值，不得超过算术平均值的10%。